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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)引起的鸡慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)是一种高度接触性呼吸道传染病,不同品种、性别和年龄的鸡均可常年感染。该病在所有养禽的国家广泛流行,给家禽业造成巨大的经济损失,寻求防控CRD的有效方法已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。研究表明,外泌体可携带miRNAs随循环系统转移到邻近及远端的细胞或组织内,在疾病的发生发展中发挥着重要的作用。因此,深入研究外泌体中的miRNAs对阐明MG的致病机理、诊断及治疗具有重要的意义。本研究分离鉴定了鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞(Chicken type Ⅱ pneumocytes,CP-Ⅱ)培养液中的外泌体,通过Hi Seq2500测序筛选MG-HS感染与未感染CP-Ⅱ外泌体中差异表达的miRNAs,进一步探究了gga-miR-451在MG-HS感染中的作用及其分子机制。主要研究结果如下:1.构建MG-HS感染的CP-Ⅱ模型,收集细胞上清,利用超速离心法提取外泌体,NTA检测其大小为30-150 nm;TEM发现其为椭圆形小囊泡,呈双层膜结构;WB发现提取的外泌体均有标志蛋白CD63和CD9的表达,且MG-HS感染组CD63和CD9的表达量显著高于正常组。说明MG-HS感染可以促进CP-Ⅱ分泌外泌体。2.Hi Seq2500测序结果显示,MG-HS感染的CP-Ⅱ分泌的外泌体与未感染组相比有30个miRNAs显著差异表达(fold-change>1),其中9个上调,21个下调;利用RNAhybrid、miRanda和PITA预测差异表达miRNAs的靶基因,通过GO及KEGG功能富集分析发现,外泌体中差异表达的miRNAs主要参与细胞周期、凋亡、MAPK和Toll样受体信号通路。选取8个差异表达的miRNAs进行RT-q PCR验证,结果显示,gga-let-7d、gga-miR-451、gga-miR-133c-3p及gga-miR-223在MG-HS感染组极显著下调,gga-miR-193a-3p与gga-miR-33-5p极显著上调,与测序结果一致;而gga-miR-460b-5p和gga-miR-202-5p在两组间的表达量无显著差异,与测序结果不符。本次外泌体miRNAs测序覆盖率为75%,small RNA-seq结果有效。3.RT-q PCR检测显示,gga-miR-451在MG-HS感染后6d、10d、11d的鸡胚肺组织、CP-Ⅱ和DF-1细胞中均极显著上调,而在MG-HS感染的CP-Ⅱ分泌的外泌体中极显著下调(3.8倍),表明gga-miR-451在MG-HS感染的CP-Ⅱ中选择性不装载进入外泌体。感染组CP-Ⅱ的外泌体(Exo-MG)通过PKH67标记后与受体细胞DF-1孵育6 h,荧光显微镜观察发现外泌体被DF-1细胞摄取;孵育36 h,RT-q PCR检测显示,Exo-MG处理组中gga-miR-451的表达量极显著低于对照组(1.8倍),提示选择性分泌的gga-miR-451在MG-HS感染中起调控作用。4.探究低表达gga-miR-451的外泌体对未感染的受体细胞DF-1的作用,Elisa检测发现,Exo-MG被受体细胞DF-1摄取后能促进细胞分泌炎性因子TNF-α和IL-1β,表明Exo-MG进入受体细胞后促进其炎症应答抵御MG-HS的感染。进一步检测gga-miR-451对正常或MG-HS感染的细胞炎性因子表达的影响,结果显示,抑制gga-miR-451可促进正常细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6,而过表达gga-miR-451可抑制感染细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6。表明低表达gga-miR-451可促进正常细胞的炎症应答,而过表达gga-miR-451可抑制感染细胞的炎症反应。5.利用生物学软件及双荧光素酶报告基因系统检测显示,gga-miR-451与YWHAZ 3’UTR种子序列结合具有较高的稳定性,过表达gga-miR-451极显著下调野生型载体的荧光素酶活性,但对突变载体的荧光素酶活性无影响;RT-q PCR及WB进一步验证发现,细胞中过表达gga-miR-451后,YWHAZ的m RNA与蛋白水平均极显著下调,且YWHAZ在MG-HS感染后6d、10d、11d的鸡胚肺组织和DF-1细胞中均极显著下调,证实YWHAZ是gga-miR-451的功能靶基因。RT-q PCR及WB进一步分析显示,Exo-MG组与对照组相比,外泌体中低表达的gga-miR-451对受体细胞DF-1中YWHAZ m RNA水平无显著差异,但蛋白水平极显著上调。说明外泌体中与细胞内的gga-miR-451均负调控细胞中YWHAZ。6.通过CCK-8、细胞周期试剂盒及细胞凋亡试剂盒检测显示,gga-miR-451抑制MG-HS感染的DF-1细胞的增殖,抑制细胞从G1期进入S+G2期,促进细胞的凋亡(P<0.01);RT-q PCR及WB检测显示,过表达gga-miR-451显著降低p MGA1.2m RNA及蛋白水平的表达。表明gga-miR-451通过抑制MG-HS感染的DF-1细胞的增殖和周期进程,促进细胞凋亡进而抑制MG-HS在DF-1细胞中的增殖。7.RT-q PCR检测显示,MG-HS感染DF-1细胞后24、48及72h,p MGA1.2的表达量极显著上调,呈时间依赖性;gga-miR-451的初级转录本(pri-miR-451)以及前体(pre-miR-451)的表达量在感染后极显著上调,说明MG-HS在转录水平上调控gga-miR-451的表达。双荧光素酶报告系统检测显示,转录起始位点上游386-254bp内存在主要转录因子的结合位点,为核心启动子区域。通过Gene-regulation和JASPAR软件预测及双荧光素酶报告系统检测表明,Ah R:Arnt三个结合位点均为重要的启动子结合位点。双荧光素酶报告系统检测与Ch IP检测结果显示,Ah R:Arnt特异性结合gga-miR-451的启动子区域,并在MG-HS感染过程中增强gga-miR-451的转录活性,是gga-miR-451的关键转录调控因子;RT-q PCR及WB进一步验证,过表达Ah R:Arnt极显著上调gga-miR-451的表达,极显著抑制靶基因YWHAZ的表达(P<0.01)。综合以上结果表明,Ah R:Arnt是gga-miR-451的核心启动子,在MG-HS感染过程中诱导gga-miR-451的上调表达,并抑制YWHAZ的表达。