固有免疫是机体抵抗外界病毒、细菌等微生物感染的第一道防线,病毒的核酸成分可以引起机体的免疫应答反应。固有免疫的激活需要模式识别受体(pattern recognition receptors.PRRs)识别病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。细胞内存在的多种模式识别受体可以识别病毒的核酸成分,如Toll 样受体(Toll-like receptors.TLRs)中的 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9,可以识别暴露于细胞内体中中的病毒RN A和DN A。细胞浆中游离的RN A成分可被维甲酸诱导基因Ⅰ受体(RIG-I-like receptors,RLRs)中的RIG-I或MDA5所识别。游离于细胞浆中的病毒DNA成分则可以被cGAS、IFI16、DDX41等DNA受体识别。天然免疫细胞的PRRs识别病毒的核酸成分后,引起一系列信号通路的活化,诱导Ⅰ型干扰素的产生,最终清除感染机体的病原微生物。线粒体抗病毒蛋白MAVS(也被称作IPS1,VISA或Cardif)是RLRs信号通路中重要的接头分子。研究表明,RNA病毒感染机体后可引起MAVS构象发生变化,形成朊蛋白样(prion-like)聚集体。MAVS朊蛋白白样聚集体的形成对RLRs信号通路的活化起着关键作用,然而MAVS形成聚集体的分了机制并不清楚。MAVS在线粒体上的定位对其功能发挥起着决定性的作用,因此我们假设定位于线粒体上的蛋白可能会对MAVS的功能有一定的调控作用。TRIM31属于E3泛素连接酶家族中的一员,在癌症等人类疾病中发挥着重要作用,也有文章报道TRIM31可以部分定位在线粒体上,因此本论文探索了TRIM31是否通过影响MAVS功能进而调控天然免疫抗病毒反应。我们的研究发现TRIM31可以正向调控MAVS所介导的Ⅰ型干扰素的生成,TRIM31特异性敲基因小鼠更加易于感染RNA病毒。具体机制依赖于TRIM31可以对MAVS第10位、第311位及第461位的赖氨酸进行K63位泛素化修饰,从而促进MAVS朊蛋白样聚集体的形成,最终促进Ⅰ型干扰素的产生。一.研究目的:探讨TRIM31是否影响MAVS所介导的信号通路,并阐明其具体分子机制,最后通过敲基因小鼠动物模型验证TRIM31影响抗病毒天然免疫的生理意义。二.研究方法:1.TRIM31在细胞内的定位将含GFP标签的TRIM31过表达载体转染到HEK293T细胞中,培养24小时后,SeV感染6小时。免疫荧光技术检测TRIM31在线粒体上的定位情况。取健康C57 BL/6小鼠腹腔原代巨噬细胞,SeV感染不同时间点后,提取线粒体蛋白,Western Blotting方法检测TRIM31在细胞浆及线粒体上的蛋白含量。2.TRIM31调控IFN-β的产生和抗病毒反应2.1 TRIM31过表达对IFN-β产生的影响在HEK293T细胞系中转染Flag标签的TRIM31过表达载体,培养24小时后,SeV感染或转染poly(I:C)系列时间点,实时荧光定量PCR方法检测IFN-β产生的变化。2.2 TRIM31干扰后对IFN-β产生的影响提取小鼠腹腔原代巨噬细胞,转染小干扰RNA减低TRIM31的表达,SeV感染不同时间点,实时荧光定量PCR和ELISA技术检测IFN-β产生及分泌。2.3TRIM31对病毒复制的影响分别转染TRIM31干扰RNA或者TRIM31过表达载体于HEK293T细胞中,用VSV感染不同时间点,实时荧光定量 PCR方法检测IFN-β产生和VSV mRNA水平的变化;利用荧光显微镜直接观察病毒的复制情况;收集细胞上清,利用病毒空斑实验检测病毒滴度情况。3.TRIM31敲除对机体抗病毒的生理意义3.1 TRIM31敲除后对IFN-β产生的影响提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,分别用5’ppp-RNA、LPS、Poly(I:C)等刺激,或者 SeV、HSV-1 感染,实时荧光定量PCR方法检测IFN-β及IFN相关基因的表达。3.2TRIM31敲除对机体中病毒复制的影响取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,用VSV或HSV-1感染不同时间点,实时荧光定量PCR方法检测IFN-β表达和病毒mRNA水平的变化;收集细胞上清,病毒空斑实验方法检测病毒滴度;Western Blotting方法检测VSV蛋白的表达变化。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠,腹腔注射VSV或HSV-1,24小时后小鼠眼球取血的到血清,ELISA检测血清中IFN-β分泌变化;取肝脏、脾脏、肺脏及脑组织,提取总RNA,实时荧光定量PCR方法检测组织中IFN-β和病毒mRNA水平的变化;提取蛋白白,Western Blotting方法检测VSV蛋白水平的变化;组织研磨得到上清,病毒空斑实验方法检测病毒滴度变化;免疫组化及HE染色方法观察组织损伤情况。4.TRIM31对RLR信号通路活化的影响将TRIM31过表达质粒转染HEK293T细胞系24小时后,SeV或HSV-1感染不同时间点,Western Blotting检测TBK-1、IRF3磷酸化情况及IRF3在胞质、胞核中的含量变化情况;非变性Western Blotting检测IRF3二聚化情况;通过双荧光素酶报告基因手段检测IRF3报告基因活性的变化情况。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,SeV或HSV-1感染不同时间点,Western Blotting检测TBK-1、IRF3磷酸化情况及IRF3在胞质、胞核中的变化情况;非变性Western Blotting检测IRF3二聚化情况。5.TRIM31靶分子的寻找将RLR信号通路中相关的接头分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等过表达载体与TRIM31表达载体共转染HEK293T细胞系,利用实时荧光定量 PCR及双荧光素酶报告基因技术检测TRIM31对不同接头蛋白所介导的IFN-β卩 mRNA表达及报告基因活性的影响。将相关接头分子过表达载体与TRIM31表达载体共转染HEK293T细胞,免疫共沉淀实验检测TRIM31与各接头分子的结合情况。6.TRIM31与MAVS结合实验提取C56BL/6小鼠腹腔原代巨噬细胞,SeV感染不同时间点,用TRIM31特异性抗体进行免疫共沉淀实验,检测内源性TRIM31与MAVS的结合。利用体外翻译系统分别得到TRIM31与MAVS的蛋白,免疫共沉淀实验检测体外表达的TRIM31与MAVS的结合情况。分别构建TRIM31的截断突变体与MAVS的截断突变体,共转染HEK293T细胞系,免疫共沉淀实验检测TRIM31与MAVS的截断突变体的结合情况,寻找TRIM31与MAVS发生结合的关键结构域。7.TRIM31对MAVS的泛素化情况将Flag标签的TRIM31过表达载体、Myc标签的目的分子过表达载体和HA标签的泛素过表达载体(WT、K48或K63)共转染HEK293T细胞系,24小时后提取蛋白,用Myc特异性抗体进行免疫共沉淀,Western Blotting检测TRIM31对目的分子泛素化水平的影响及泛素化形式的影响。构建一系列Myc标签的MAVS赖氨酸点突变过表达载体,分别与Flag标签的TRIM31过表达载体和HA标签的泛素过表达载体共转染HEK293T细胞系,24小时后提取蛋白,免疫共沉淀技术检测TRIM31对不同赖氨酸点突变载体泛素化的影响,探讨MAVS上被TRIM31催化形成泛素链的赖氨酸位点。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,SeV感染不同时间点后,提取细胞蛋白,利用MAVS特异性抗体进行免疫共沉淀,Western Blotting方法检测TRIM31对MAVS内源性泛素化水平的影响。将MAVS构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Myc过表达载体,将TRIM31构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Flag过表达载体上,使用Promega公司的体外转录翻译系统(TNT Quick Coupled Transcription/Translation System)对表达载体进行体外转录翻译,将翻译的蛋白,加入BostonBiochem公司生产的体外泛素修饰系统(包含El,UbcH5a,K48.K63,K48R或者K63R等蛋白),室温反应,使用Myc标签抗体进行免疫共沉淀,检测TR1M31对MAVS进行invitro泛素化的情况及泛素化形式。8.TRIM31通过E3连接酶活性影响RLR信号通路构建TRIM31泛素连接酶功能缺失点突变载体,利用实时荧光定量PCR技术,双荧光素酶报告基因技术,Western Blotting技术检测TRIM31泛素连接酶功能缺失后对RLR信号通路介导的IFN-β产生的影响,对病毒复制的影响,对MAVS泛素化的影响,以及对MAVS多聚化形成的影响。9.基因恢复实验进一步证实证明TRIM31通过泛素化MAVS影响RLR介导的信号通路提取TRIM31缺陷MEF细胞,分别转染空对照载体、野生型TRIM31过表达载体及E3泛素连接酶功能缺失点突变过表达载体,用实时荧光定量PCR技术,双荧光素酶报告基因技术,Western Blotting技术检测特异性恢复TRIM31基因表达后对IFN-β产生的影响,对病毒复制的影响,对MAVS泛素化的影响,以及对MAVS多聚化形成的影响。10.TRIM31对MAVS形成朊蛋白样多聚体的影响转染TRIM31过表达载体于HEK293T细胞系,或者用TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞,SeV感染不同时间点后,提取细胞线粒体,直接利用SDD-AGE方法检测TRIM31过表达或者缺失后对MAVS朊蛋白样多聚体形成的影响;或者将提取的SeV预刺激的线粒体进行体外泛素化修饰,反应结束后,再SDD-AGE方法检测TRIM31对MAVS体外朊蛋白样多聚体形成的影响。三.实验结果1.RNA病毒感染介导TRIM31募集到线粒体上有文献报道,TRIM31分布于线粒体上及细胞浆中,为了进一步研究RNA病毒感染是否影响TRIM31在线粒体的定位,我们将含有GFP标签的TRIM31过表达载体转染到HEK293T细胞中,培养24小吋后,再感染SeV6小时,利用线粒体标记蛋白作为参照,免疫荧光技术观察TRIM31在线粒体上的定位情况。我们发现SeV病毒感染介导了TRIM31向线粒体上募集。提取C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬细胞,SeV感染不同吋间点后,提取线粒体蛋白,用Western Blotting方法检测TRIM31在线粒体上的含量,我们发现细胞SeV病毒感染后,定位于线粒体上TRIM31蛋白含量明显增加。以上结果提示我们RNA病毒感染会引起TRIM31向线粒体的募集。2.TRIM31正向调控RLR介导的IFN-β的产生进而增强天然免疫抗病毒反应2.1 TRIM31过表达促进RNA病毒介导的IFN-β的产生为了探究TRIM31是否影响RLR信号通路,在HEK293T细胞或Hela细胞中转染Flag标签的TRIM31过表达载体,培养24小时后,SeV分别感染4小时、8小时、12小时或转染poly(I:C)6小时、12小时,实时荧光定量PCR的方法检测IFN-β mRNA水平的变化,我们发现TRIM31过表达后,SeV感染及poly(I:C)转染引起的IFN-β mRNA水平明显升高。这预示着TRIM31正向调控RLR所介导的IFN-β的产生。2.2 TRIM31干扰抑制RNA病毒介导的IFN-β的产生。为了进一步明确TRIM31在RLR信号通路所起的作用,我们合成了 TRIM31小鼠源和人源的小干扰RNA,提取小鼠腹腔原代巨噬细胞,用转染小干扰的方法将降低TRIM31的表达,SeV分别感染4小时、8小时、12小时,实时荧光定量PCR技术和ELISA技术检测IFN-β3产生及分泌。结果显示,TRIM31干扰后,SeV感染所介导的IFN-β的在m RNA水平及分泌水平都出现明显下降,这进一步证明了 TRIM31可以正向调控RLR所介导的IFN-β的产生。2.3 TRIM31的抗病毒作用为了研究TRIM31对机体的抗病毒作用,转染TRIM31特异性小干扰RNA或者TRIM31过表达载体于HEK293T细胞系,掊养24小时候,用含有绿色荧光蛋白的VSV-GFP进行感染,实时荧光定量PCR技术检测IFN-β的产生和VSV mRNA水平的变化;利用荧光显微镜直接观察病毒的复制情况;收集细胞上清,进行病毒空斑实验检测病毒滴度。我们发现TRIM31十扰后,VSV感染引起IFN-βmRNA水平表达明显下降,进而使得VSV病毒逃逸并大量复制。病毒空斑实验同样发现TRIM31干扰组中VSV病毒滴度明显升高。相反的,过表达TRIM31之后,VSV介导的IFN-βmRNA水平的产生明显升高,VSV病毒mRNA水平明显下降,荧光显微镜观察病毒的复制能力减弱,病毒空斑实验证明TRIM31过表达组的VSV病毒滴度明显下降。由此我们可以看到TRIM31在机体抗病毒中起着十分重要的作用。3.TRIM31抗病毒的生理意义3.1 TRIM31缺陷抑制RNA病毒引起的IFN-β产生为了进一步验证TRIM31在RLR信号通路中所起的作用及TRIM31抗病毒的生理意义,我们构建了 TRIM31特异性敲基因小鼠,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,分别使用LPS、Poly(I:C)等TLR通路配体刺激细胞,SeV、VSV等RLR通路配体感染细胞,HSV-1等DNA配体感染细胞,实时荧光定量PCR方法检测IFN-β及IFN相关基因ISGs的表达差异,我们发现SeV感染或5’ppp-RNA转染后,TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬细胞所表达的IFN-β以及IFN-β相关基因如Cc15、Cxc1 10的表达明显下降。而使用LPS、Poly(I:C)刺激或HSV-1感染的野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞所表达的IFN-β以及IFN-β相关基因无明显变化差异。我们分别提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的胚胎成纤维细胞或者骨髓来源巨噬细胞,重复上面的实验,得到相似的结论。这说明TRIM31特异性敲除可以明显抑制RNA病毒介导的I型干扰素的生成,而对TLR信号通路等没有影响。3.2 TRIM31敲基因小鼠更易于感染RNA病毒由于Ⅰ型干扰素与病毒的复制、清除有着直接关系,我们进一步研究了 TRIM31在机体抵抗病毒复制方面的生理意义,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,然后用VSV或HSV-1进行感染,实时荧光定量PCR技术检测IFN-β和VSV在mRNA水平的变化;收集细胞上清,利用病毒空斑实验检测病毒滴度差异。收取细胞蛋白,Western Blotting方法检测VSV蛋白水平的表达差异。我们发现与野生小鼠相比较,TRIM31敲基因小鼠被VSV感染后产生IFN-β在mRNA水平明显下降,而VSV在mRNA水平则明显升高;病毒空斑实验显示TRIM31敲基因小鼠VSV病毒滴度明显升高。我们通过腹腔注射VSV病毒的方法建立小鼠的RNA病毒感染模型,观察小鼠的死亡率,绘制小鼠生存曲线,发现TRIM31敲基因小鼠在病毒感染后的死亡率史高;小鼠眼球取血得到血清,ELISA方法检测TRIM31敲基因小鼠感染后血清中IFN-β的产量明显低于野生型小鼠;处死小鼠后取肝脏、脾脏和肺脏,提取组织总RNA和蛋白,实时荧光定量PCR方法检测到TRIM31敲基因小鼠感染后的肝脏、脾脏和肺脏中IFN-β3的表达明显低于野生型小鼠,而VSV的mRNA则明显高于野生型小鼠;Western Blotting方法检测同样发现TRIM31敲基因小鼠感染后各组织中VsV蛋白含量也是明显高于野生型小鼠;肝脏、脾脏和肺脏等组织研磨得到上清,病毒空斑实验检测病毒滴度,发现TRIM31敲基因小鼠感染后的病毒滴度明显高于野生型小鼠;取小鼠肺脏组织进行免疫组织化学及HE染色,观察肺损伤情况,发现TRIM31敲基因小鼠病毒感染后肺损伤比野生型小鼠更加严重。以上结果说明相比于野生型小鼠,TRIM31敲基因小鼠更容易感染RNA病毒。我们通过腹腔注射HSV-1病毒的方法建立小鼠的DNA病毒感染模型重复以上实验,则发现,野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠在抵抗DNA病毒的过程中没有明显的差异。4.TRIM31对RLR信号通路活化的影响RLR信号通路活化后可以引起TBK1的自身磷酸化及激酶活性的激活,进而引起IRF3的磷酸化,磷酸化后的IRF3发生二聚化并入核,结合到IFN的启动子区域,引起IFN-β的产生。因此,TBK1的磷酸化及IRF3的磷酸化、二聚化、入核代表RLR信号通路的活化。我们转染TRIM31过表达载体于HEK293T细胞系,分别用SeV感染4小时、8小时、12小时,Western Blotting检测发现TRIM31过表达后病毒介导的TBK-1和IRF3磷酸化明显增强,IRF3进入细胞核中的含量也明显增加,利用非变性Western Blotting发现过表达TRIM31可以促进病毒介导的IRF3二聚体的形成。利用双荧光素酶报告基因技术检测IRF3活性的变化,将IRF3的报告基因与TRIM31过表达质粒共转染HEK293T,SeV感染后,我们发现过表达TRIM31明显促进病毒介导的IRF3的报告基因的活性。利用DNA病毒HSV-1感染细胞,利用以上手段发现TRIM31过表达并未影响DNA病毒介导的TBK1、IRF3的磷酸化。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬细胞,分别用SeV感染细胞,Western Blotting检测手段发观TRIM31敲除后SeV介导的TBK-1和IRF3磷酸化明显减弱,IRF3进入细胞核中的含量也明显减少,利用非变性Western Blotting发现TRIM31敲除可以抑制IRF3 一聚体的形成。利用DNA病毒HSV-1感染细胞,重复上述实验,发现HSV-1介导的TBK1及IRF3的活化并未受到影响。以上结果从多个层次说明TRIM31特异性促进RLR信号通路的活化,而对DNA病毒介导的信号通路活化没有影响。5.TRIM31靶分子的寻找前面结果表明TRIM31促进RNA病毒引起的IFN-β的产生,对病毒的复制起着明显的抑制作用。那么TRIM31是如何影响RLR所介导的信号通路的,具体的作用靶点是什么。接下来,我们将RLR信号通路中相关的接头分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、1RF3-5D等接头蛋白的过表达载体与TRIM31表达载体共转染HEK293T细胞系,利用实时荧光定量PCR及双荧光素酶报告基因技术检测TRIM31对不同接头蛋白所介导的IFN-β m RNA产生及报告基因活性的影响,我们发现TRIM31过表达明显可以促进RIG-I、MDA5、MAVS接头蛋白所介导的IFN-β3 mRNA的产生以及IFN-β报告基因活性,而对接头TBK1、IKKε、IRF3-5D介导的IFN-β的产生没有影响。结合之前我们发现TRIM31在RNA病毒感染后可以募集到线粒体上的现象,提示我们TRIM31作用靶点有可能是MAVS。为了进一步验证这一假设,我们将RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接头蛋白的过表达载体与TRIM31过表达载体共转染HEK293T细胞系,免疫共沉淀实验检测TRIM31与各接头分子的结合情况,结果显示TRIM31与MAVS有明显结合作用,而与其他接头分子没有结合作用。因此我们得出结论TRIM31 可能通过靶向MAVS进而调控RLR所介导的信号通路。6.TRIM31的coiled-coil结构域与MAVS的proline-rich结构域相结合为了更加细致深入的研究TRIM31与MAVS的结合情况,我们进一步检测了它们内源性的结合情况,提取小鼠腹腔原代巨噬细胞,SeV感染不同时间点,用内源性TRIM31抗体进行免疫共沉淀实验,检测内源性TRIM31与MAVS的结合,我们观察到随着病毒感染时间的增加,TRIM31与MAVS结合也逐渐增强,两者的结合存在时间依赖性。为了进一步验证两者是否是直接性结合,我们利用体外翻译系统,过表达TRIM31与MAVS的蛋白,免疫共沉淀实验检测发现外源性表达TRIM31 与 MAVS发生了直接结合。为了探究TRIM31与MAVS发生结合的具体结构域,我们构建了一系列TRIM31 与 MAVS的截断突变体,将各截断体共转染HEK293T细胞系,免疫共沉淀实验检测TRIM31与MAVS的截断突变体的结合情况,实验表明TRIM31的coiled-coil结构域与MAVS的proline-rich结构域在TRIM31与MAVS的结合过程中起着重要的作用。7.TRIM31对MAVS的泛素化实验TRIM31属于TRIM家族,是E3泛素连接酶的一种,因此我们想进一步明确TRIM31对MAVS是否进行了泛素化修饰。我们将Flag标签的TRIM31过表达载体,Myc标签MAVS过表达载体和HA标签的泛素表达载体共转染HEK293T细胞系,培养24小时后提取蛋白,用Myc特异性抗体进行免疫共沉淀,Western Blotting结果显示TRIM31 可以促进MAVS的K63位泛素化修饰。MAVS分子上共有14个赖氨酸位点,为了详细阐明TRIM31对其中哪个氨基酸位点进行了泛素化修饰,我们构建了 一系列MAVS赖氨酸点突变过表达载体,与TRIM31过表达载体及泛素过表达载体共转染HEK293T细胞系,免疫共沉淀技术及Western Blotting技术检测发现发现TRIM31主要将MAVS上的第10位,第311位,第461位赖氨酸进行K63位泛素化修饰。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,SeV感染不同时间点,提取细胞蛋白,利用MAVS内源性抗体进行免疫共沉淀,Western Blotting技术检测发现TRIM31敲除后SeV介导的MAVS内源性K63位泛素化水平明显下降,而TRIM31对MAVS的K48位泛素化修饰无明显影响。我们进一步通过体外蛋白翻译系统和体外泛素化系统,检测TRIM31对MVAS的体外泛素化修饰情况,结果表明TRIM31可以在体外系统直接促进MAVS的K63位泛素化修饰。以上结果表明,E3泛素连接酶TRIM31可以将MAVS的第10位,第311位,第461位赖氨酸进行K63位泛素化修饰。8.TRIM31通过其E3泛素连接酶功能对RLR信号通路的影响为了进一步验证TRIM31是否通过其E3泛素连接酶功能影响RLR信号通路,我们构建了 TRIM31泛素连接酶功能缺失点突变过表达载体,通过实时荧光定量PCR技术、双荧光素酶报告基因技术、Western Blotting技术检测发现缺失了 E3泛素连接酶功能后,TRIM31对RLR信号通路介导的IFN-β的产生失去了促进作用,TRIM31的抗病毒作用也随即消失。以上结论说明TRIM31通过其E3泛素连接酶活性促进RLR介导的I型干扰素的产生及抗病毒作用。9.TRIM31促进MAVS的多聚化TRIM31对MAVS进行K63位泛素化修饰的机制我们已做了大量研究,然而TRIM31对MAVS修饰后如何调控MAVS的功能是我们进一步要探讨的重要问题。已有文章报道MAVS在RNA病毒感染后形成朊蛋白样多聚体,该多聚体的形成对于MAVS进一步活化下·游信号通路起到至关重要的作用,然而MAVS如何形成朊蛋白白样多聚体还不得而知。因此我们进行实验验证TRIM31对MAVS的K63泛素化修饰是否促进MAVS多聚体的形成。我们分别转染空载体及TRIM31过表达载体于HEK293T细胞系,SeV感染不同时间点后,提取细胞线粒体,利用SDD-AGE技术检测发现TRIM31过表达明显促进SeV介导的MAVS多聚体的形成。我们进一步提取SeV预刺激后巨噬细胞的线粒体,与体外翻译得到的TRIM31蛋白共同加入体外泛素化系统,反应结束后,SDD-AGE检测发现TRIM31体外明显促进SeV介导的MAVS多聚体的形成。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬细胞,SeV感染不同时间点,提取线粒体蛋白,SDD-AGE技术检测发现TRIM31敲除后明显抑制SeV介导的MAVS多聚体的形成。以上实验表明TRIM31可以促进MAVS朊蛋白样多聚化的形成,进而影响MAVS的活化及IFN-β的产生。10.基因恢复实验证明TRIM31特异性调控MAVS活化及RLR介导的信号通路我们提取TRIM31敲基因小鼠MEF细胞,分别转染空载体及TRIM31过表达载体,SeV或VSV感染细胞,分别使用实时荧光定量PCR技术,双荧光素酶报告基因技术,ELISA技术,Western Blotting技术进行检测,我们发现TRIM31基因敲除后SeV诱导的MAVS形成朊蛋白样多聚体的能力减弱,IFN-β产生减少,病毒复制明显增加;重新过表达TRIM31后,由TRIM31缺陷导致的对RLR信号通路及病毒复制的影响随即消失。以上结果进一步证明了 TRIM31对于RLR介导信号通路的影响。我们同样利用基因恢复实验进一步验了MAVS的K63位泛素化对RLR信号转导过程的影响,在MAVS特异性敲除MEF细胞中,重新转染野生型MAVS过表达载体、K10、K311、K461位赖氨酸位点突变MAVS过表达载体与野生型TRIM31过表达载体、E3连接酶功能缺失点突变过表达载体载体,SeV或VSV感染一系列时间点,利用实时荧光定量量PCR,双荧光素酶报告基因技术,Western Blotting技术检测发现,MAVS敲除后,SeV介导的RLR信号通路被阻断,重新转染野生型MAVS 后,RLR介导·的I型十扰素产生得到恢复;TRIM31过表达促进RLR介导的Ⅰ型十扰素的生成;然而转染K10、K311、K461位赖氨酸位点突变MAVS表达载体后,RLR介导的信号通路的阻断不能得到恢复。以上结果说明TRIM31对于MAVS的K10、K311、K461位赖氨酸位点的K63位泛素化直接影响MAVS活化及RLR信号通路的转导。四.结论及创新性1.首次证明了 TRIM31在RLR信号通路中发挥作用TRIM31属于TRIM家族中的一员,已有研究表明TRIM31在消化系统相关癌症中发挥着重要作用。然而TRIM31是否参与到天然免疫信号转导目前还没有报道。我们首先发现了 TRIM31在RNA病毒介导的天然免疫信号转导及机体抗病毒反应中发挥着重要的调控作用。2.首次发现了对MAVS进行K63位泛素化修饰的分子对于MAVS的泛素化修饰大多集中在K48位泛素化修饰,至今仍未发现对MAVS发生K63位泛素化修饰的分子,我们的发现填补了这一空白。我们发现TRIM31促进IFN-β的产生,这一现象是通过其E3泛素连接酶对MAVS进行K63位泛素化修饰引起的;同时我们明确了对TRIM31对MAVS泛素化修饰的位点,分别是MAVS第10位,第311位,第461位赖氨酸。3.为探索影响MAVS多聚化形成的因素提供了新思路MAVS作为RLR信号通路重要的接头蛋白,RNA病毒感染机体后,MAVS构象发生改变,形成朊蛋白样多聚体,该多聚体的形成是MAVS活化下游信号通路的前提条件,然而对于MAVS多聚化形成的调节机制并不明确。我们研究发现,SeV感染后,TRIM31募集到线粒体上,并与MAVS结合并促进MAVS发生K63位泛素化修饰,这种K63位的修饰调控MAVS朊蛋白样多聚体的形成,进而促进IFN-β的产生,发挥抗病毒作用。4.为临床抗病毒研究提供了潜在的治疗靶点病毒感染仍旧是全世界面临的重要问题,病毒的高变异性更给我们治疗病毒性疾病带来巨大的难度。我们研究发现TRIM31可以靶向MAVS促进IFN-β的产生,发挥抗病毒作用。这一发现,可以为临床治疗病毒感染性疾病提供新思路与治疗靶点。