目的:肝脏在人体内担负着复杂的生理功能，对维持生命和内环境的稳定起重要的作用。然而，急性肝衰竭、肝硬化等终未期肝病目前仍是医学界难以解决的问题，死亡率非常高。我国是肝病大国，每年因肝病死亡者人数众多。目前肝移植虽然是治疗各种终末期肝病的有效方法，但是存在供体来源困难、手术复杂、患者需终生接受免疫抑制治疗、费用昂贵等缺点，无法广泛开展。肝组织工程的研究和进展给终末期肝病的治疗带来了新的希望。肝组织工程即把合适的种子细胞与生物支架材料相结合，在一定的微环境下，经过诱导培养，形成一定量的肝实质细胞和组织，再移植到患者体内以修复或替代肝脏的功能；其最终目标是构建一个完整的、有功能的、可移植的肝脏。 肝组织工程研究的首要任务就是选择可靠的并能提供足够数量的种子细胞。胚胎干细胞由于伦理问题，其研究和应用受到一定限制；肝细胞株和肝干细胞因其具有成瘤倾向而不适宜体内移植；成熟肝细胞也有细胞获取难度较大、异基因肝细胞可能产生免疫排斥反应、体外培养易失去活性与功能等诸多不足，不能成为满意的种子细胞。近年来，有关骨髓间质干细胞(bonemesenchymalstemcell，MSC)的研究给肝组织工程种子细胞带来了新的选择。 MSC是骨髓基质细胞的重要组成成分，不但与其他细胞一起支持造血干细胞造血，同时还表现出较强的可塑性，在不同的诱导条件下.能够分化为多种组织细胞；同时MSC还具有分离培养容易、体外可大量扩增、遗传背景相对稳定、体内植入反应弱、易于接受外源基因的导入和表达等优点。目前虽然已有众多的研究证明在体内MSC是肝脏修复过程中重要的肝外来源，在体外MSC也能在平面上被诱导分化为肝细胞，然而MSC要成为肝组织工程的种子细胞则必须与生物支架结合，并在立体结构上成肝诱导，这方面鲜有报导。因此研究MSC在三维立体支架上的成肝诱导方法，使MSC成为肝组织工程的种子细胞，同时将扩增的MSC及支架复合物在体外重塑形成具有一定功能的肝组织，或是进行体内移植以替代损伤的肝细胞，不仅具有非常重要的理论意义，也具有良好的临床应用前景。 肝组织工程的另一个研究内容即研发合适的支架材料。由于肝组织是代谢性软组织，它对材料的力学性能要求与骨组织相比要低得多，而对细胞外基质蛋白的生物活性及微环境仿生要求更高。从这个意义上来讲，诸如海藻酸、壳聚糖、胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸等天然基质材料更适用于肝组织工程。海藻酸是从褐藻中提取的一种酸性多糖，由古洛糖醛酸与甘露糖醛酸组成的嵌段聚合物，可与二价金属离子偶联形成水凝胶。海藻酸支架具有良好的亲水特性，疏松多孔的立体结构和优越的组织相容性，已经被作为细胞载体在组织工程研究包括肝组织工程上广泛应用。 本研究拟通过构建海藻酸支架—MSC复合物，并在立体结构上诱导MSC向肝细胞分化来探讨在体外构建MSC源性的人工肝组织的可能性；同时将其移植到肝功能不全大鼠体内来检测此复合物是否能够在肝功能不全大鼠体内能否实现肝脏功能的支持作用，为MSC和海藻酸支架在肝组织工程的进一步应用提供实验基础。 第一部分海藻酸支架—MSC复合物的构建及其生物相容性的研究 一、材料与方法: 1.MSC的分离、培养、扩增及检测 Wistar大鼠断颈处死后无菌条件下取出股骨及胫骨，用含10％胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，离心后弃去上清并用DMEM重悬接种培养，按1:2传代，传至3～4代细胞备用。另取第3代MSC进行流式细胞仪检测鉴定和诱导成骨鉴定。 2.海藻酸三维支架的构建 吸取3％的海藻酸钠水溶液700μl滴入24孔塑料培养板的孔中，在孔内形成约1mm厚度的圆盘，再滴入0.1％的CaCl22ml于圆盘上，静置40min。待凝胶形成后弃去CaCl2，改用2mlα—2MEM浸泡，放入4℃冰箱，每24h更换α2MEM一次，72h后用于细胞培养。 3.MSC与海藻酸支架复合物的构建 将海藻酸三维立体支架放置于24孔板内，将含有1×106细胞的MSC悬液约200μl滴注于支架上并放置于培养箱内。 4.MSC与海藻酸支架复合物相容性的检测 4.1普通显微镜观察定期于倒置相差显微镜下观察MSC在支架上的黏附及增殖情况。 4.2扫描电镜观察细胞与支架复合物共同培养7天后于冰冻干燥箱内干燥24h，表面喷金后于Philps扫描电镜下观察。 4.3MTT实验取第一代(P1)、P3、P5的MSC悬液，以1×104个/孔接种在放置于96孔培养板中的海藻酸三维立体培养支架上，加200μl细胞培养基，37℃恒温细胞培养箱中培养。培养第1、3、5、7、9、11、13、15天，各代次分别随机抽取3孔，进行MTT测定。 4.4组织学检测海藻酸支架和MSC复合物体外培养3天后4％多聚甲醛固定24h，常规酒精逐级脱水，石蜡包埋切片，行HE染色后观察。 二、结论: 1.海藻酸三维支架具有适合作为细胞载体的特性和结构。 2.MSC与海藻酸三维支架具有良好的相容性，MSC在海藻酸三维支架上能良好地附着并生长。 第二部分利用海藻酸支架—MSC复合物体外构建人工肝组织的研究 一、材料与方法: 1.海藻酸支架—MSC复合物的构建 2.诱导液的配置及诱导方法 60％DMEM，40％MCDB—201，1mg/ml牛血清蛋白(BSA)，10-8M地塞米松，10-4M维生素C，2％胎牛血清，10ng/mlEGF，20ng/mlHGF，10ng/mlFGF—4。将MSC按上述方法种植于支架并放置于24孔板内24h后加入诱导液，量约1ml/孔，每天换液，并于普通显微镜下观察细胞情况。 3.被诱导的细胞表达肝细胞特异性功能的检测 3.1培养液尿素(UREA)、白蛋白(ALB)测定于诱导后的第7、14、21、28天将诱导液更换为不含胎牛血清的诱导液培养24h后吸取上清按照尿素氮检测试剂盒和白蛋白液体试剂盒操作。 3.2RT—PCR法检测被诱导细胞内肝细胞标志物的表达(AFP、ALB、Cox32、CYP7A1) 在诱导后的第14和28天时提取细胞总RNA，检测甲AFP和ALB基因的表达情况，并于第28天检测Cox32和CYP7A1的表达。 3.3免疫荧光法检测CK-18的表达诱导后的第28天取出支架与细胞复合物行冰冻切片，用羊抗鼠CK-18抗体和兔抗羊IgG(H+L)/TRITC孵育后于荧光显微镜下观察。 3.4CK-18阳性率的检测将完成CK-18染色的切片共10张，用Hoechst3328将切片上的所有细胞染核后检测CK-18的阳性表达率。 3.5糖原染色检测被诱导细胞糖原储存功能另取部分切片，AAF液固定后PAS染色检测支架上细胞糖原储存功能。 二、结论:以EGF、HGF、FGF—4等细胞因子混合液为诱导因子，能在海藻酸三维支架上成功诱导MSC向肝细胞分化；海藻酸三维支架和MSC在体外可望成为肝组织工程理想的种子细胞和细胞载体。 第三部分海藻酸支架—MSC复合物治疗大鼠肝功能不全的研究 一、材料与方法: 1.MSC的培养、CM—DIL标记MSC的培养见第一部分。在MSC悬液内加入CM—DIL液约5μl，37℃孵育10min，4℃冰箱放置20min，PBS洗3遍后待用。 2.MSC与海藻酸三维支架复合物的构建 3.实验分组及处理实验分独立的70％肝切除大鼠组(A组)和肝硬化大鼠组(B组)，每组20只大鼠，雌雄各半。A、B两组各细分实验组(A1和B1)和对照组(A2和B2)。A1和B1组给予MSC—海藻酸支架复合物，A2和B2组则单独给予海藻酸支架。 4.荧光显微镜下观察标记了CM—DIL的MSC和支架细胞复合物将种植在24孔板内的支架细胞复合物放置于荧光显微镜下在波长为540-650nm范围内观察。 5.冰冻切片观察支架细胞复合物体内应用后情况手术后的第4周处死实验组和对照组大鼠并取出支架细胞复合物，行冰冻切片并固定后置于荧光显微镜下观察，并用Hoechst染核。 6.免疫组化法检测复合物内白蛋白的表达取部分切片用羊抗鼠ALB溶液及驴抗羊液体孵化，DAB显色法检测。 二、结论： 　1.CM—Dil可以做为细胞体内示踪的稳定的染料。 　 2.在70％肝切除大鼠和肝硬化大鼠体内，支架上的MSC可以分泌白蛋白并合成糖原，已初步具备肝细胞的功能；此复合物在肝功能不全的大鼠体内可以起到一定肝脏支持的作用。