微管是构成真核生物细胞骨架的主要成分,它在细胞的生命活动过程,例如有丝分裂,细胞生长和分化等方面起着重要作用。微管的基本组成单位是α-/β-微管蛋白动态异二聚体,而β-微管蛋白基因是多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的作用靶标,其特异位点的突变将引起对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性。小麦赤霉病是世界范围内一种重要的流行性病害,不仅严重影响产量,而且降低小麦品质。禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）是引起赤霉病的最主要病原菌之一。它可以产生包括脱氧雪腐镰孢菌烯醇（Trichothecenes, DON）和雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol,NIV）在内的多种真菌毒素及次生代谢物质,引起人类和哺乳动物中毒,严重威胁着人和动物的健康。因此人们以减轻病害为目的,开发了一系列综合防治策略。其中化学防治,尤其是在花期喷施多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂,为我国近30年来有效防治赤霉病发挥了重要作用。但是,目前已知道在苏皖等小麦主产区,禾谷镰孢菌对微管蛋白抑制剂多菌灵普遍产生了抗药性,局部地区防治效果下降甚至丧失。本文通过以不同方式点突变基因,研究了禾谷镰孢菌两个β-微管蛋白基因变异对多菌灵敏感性及主要生物学性状的影响,为禾谷镰孢菌的抗药性治理提供了重要的理论依据。利用体外人工点突变技术,构建了禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因（β2-tub）（FGSG₀6611.3）编码第50位氨基酸（TAC→TGC/Tyr→Cys）、167位氨基酸（TTT→TAT/Phe→Tyr）、200位氨基酸（TTC→TAC/Phe→Tyr）和198位氨基酸（GAG→CAG/Glu→Gln）或（GAG→AAG/Glu→Lys）的突变片段。通过原生质体转化的方法,将突变片段导入禾谷镰孢菌β2-tub敲除体,同源置换筛选标记基因,从而成功获得了禾谷镰孢菌β2-tub定点突变体。对这些突变体的药敏性及生物学性状研究结果表明,禾谷镰孢菌β2-tub第50位氨基酸突变（TAC→TGC）可导致该菌对多菌灵低抗,第167位氨基酸突变（TTT→TAT）可导致该菌对多菌灵中抗,第200位氨基酸突变（TTC→TAC）可导致该菌对多菌灵中抗,第198位氨基酸突变（GAG→AAG）可导致该菌对多菌灵高抗,第198位氨基酸突变（GAG→CAG）可导致该菌对多菌灵低抗。不同位点氨基酸残基的改变可引起不同水平的抗药性。然而,这些不同位点的点突变体与野生型敏感菌株相比,在菌丝生长速率、无性和有性生殖能力及致病力等方面无显著差异。利用在线服务器（http://www.expasy.ch/swissmod/）,对禾谷镰孢菌β2-tub进行同源模建,获得其三维分子结构模型,将研究的突变位点标记在β2-tub分子模型上,发现这些突变位点可能构成了一个苯并咪唑分子的结合域。同时,禾谷镰孢菌中还存在一个β1-微管蛋白基因（β1-tub）（FGSG₀9530.3）,本研究在体外构建了以潮霉素为筛选标记的β1-tub敲除载体,通过原生质体转化的方法,将敲除片段导入之前获得的β2-微管蛋白基因定点突变体和野生型菌株中,获得禾谷镰孢菌β1-tub敲除突变体。通过测定菌株的营养生长特性、生殖生长能力、致病力及对多菌灵敏感性等生物学特性,来研究β-tub在禾谷镰孢菌生长发育及对多菌灵抗药性中的作用。结果表明,β1-tub敲除突变体菌丝生长变慢、致病力降低,但是无性生殖能力增强。所有菌株在敲除β1-tub后对多菌灵的抗性水平增加,同时β2-tub的表达水平上升,说明β1-tub对β2-tub的表达及抗药性具有负调控作用。利用构巢曲霉强启动子连接禾谷镰孢菌β2-tub,构建了β2-tub过表达载体。通过原生质体转化的方法,将突变片段导入禾谷镰孢菌β2-tub敲除体,同源置换筛选标记基因,从而成功获得了禾谷镰孢菌β2-tub过表达突变体。结果表明,除了分生孢子产量提高以外,β2-tub过表达突变体其它生物学表型的变化不显著。但是其对多菌灵的敏感性显著降低,说明β2-tub可能是多菌灵的作用靶标。β2-tub的表达水平与对多菌灵的敏感性有关,但是它是一个次要的抗性机制,敏感菌株β2-tub过表达后最低抑制浓度仍然小于1.4μg·mL-1。利用在线服务器,对禾谷镰孢菌β-tub进行同源模建,获得其三维分子结构模型,将上述研究的突变位点标记在β1-tub分子模型上,发现这些突变位点同样可能构成了一个苯并咪唑分子的结合域。比对β1-tub和β2-tub的氨基酸序列,发现除了240位氨基酸存在差异,与多菌灵抗性有关的特异位点的密码子序列相同。这可能与药剂识别及两个基因对多菌灵的敏感性差异有关。近年来,禾谷镰孢菌全基因组测序工作的完成加速了对禾谷镰孢菌致病相关基因的发掘,同时也为从基因组水平上认识禾谷镰孢菌致病分子机理提供了一个新的平台。本研究对禾谷镰孢菌野生型菌株2021,β2-tub敲除突变体DN83和β2-tub定点突变体F167Y进行高通量标签测序。每个样品测序共获得大约六百万个原始标签。去除一些低质的标签,2021、DN83和F167Y分别获得5678673,6013236和5893596个有效序列,分别对应94393,84202和103338个有效标签。所有有效标签与禾谷镰孢菌数据库进行比对,15%的有效标签可以对应特异性的参考基因。对表达差异基因的分析结果表明,这些样本在基因类型和基因表达丰度上存在较大差异。敲除突变体DN83与野生型菌株2021相比,246个基因表达上调,1883个基因表达下调。14个功能性的转录因子表达显著下调,17个研究证实与营养生长、无性生殖能力和致病力有关的蛋白激酶表达显著下调。同时,在突变体中,多个参与致病的基因较野生型菌株表达亦显著下调。14个与药剂和有毒物质输出有关的三磷酸腺苷结合盒转运体（ATP-Binding Cassette transporter）表达下调。这些结果表明,β2-tub除了具有和β2-tub参与组装微管的功能以外,还可能通过与上述这些基因互作,参与调节禾谷镰孢菌的重要生命活动。定点突变体F167Y与野生型菌株2021相比,1036个基因表达上调,401个基因表达下调。实时定量PCR结果表明,β2-tub167位定点突变能够激活异戊二烯途径和单端孢霉烯途径,从而增强DON的合成。