目的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是危害人类健康的主要疾病之一，对AS发病机制的研究一直是热点。虽然人们先后提出脂质浸润学说、中膜平滑肌增殖学说、血栓源学说等，但都不能对AS的发病机制提供满意的解释。1999年Ross等提出“AS是一种炎症性疾病”的概念，指出AS是具有慢性炎症反应特征的病理过程，其发展过程始终伴随炎症反应。近年来许多研究认为AS与感染肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae，Cpn）有关，本课题组曾报道肺炎衣原体感染血管内皮细胞（vascularendothelial cell，VEC）后，细胞上清中TNF-α含量增加，黄芩苷高、中、低剂量均可使之下调。本研究在前期研究基础上，继续观察了黄芩苷对TNF-α诱导的血管内皮细胞损伤的影响，以进一步探讨黄芩苷的抗损伤机制。方法1．人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞的培养将HUVEC在25cm²的培养瓶内，以含体积分数为15％的小牛血清，100U／ml青、链霉素双抗液的RPIM-1640培养液，在37℃，体积分数为5％CO₂培养箱内培养，当长至80％融合时，用含胰蛋白酶-ED7A消化，传代。2．TNF-α及黄芩苷联合对HUVEC增殖的影响取对数生长期的HUVEC以2.5×10⁵／ml浓度接种于96孔板，每孔100μl，待长成单层后，加入TNF-α50ng／ml为模型组，加入黄芩苷120μg／ml、60μg／ml、30μg／ml预处理24h后，再加入TNF-α为黄芩苷高、中、低剂量组，并设立不加任何刺激物者为正常组，正常细胞加黄芩苷组，每组设8个复孔。放置37℃、5％CO₂的培养箱内培养24h；结束前4h每孔加入四甲基偶氮唑盐（MTT）20μl，4h后每孔再加150μl二甲基亚砜（DMSO），待沉淀完全溶解后，酶标仪在波长570nm处测OD值。3．流式细胞仪检测HUVEC表面CD54、CD106的表达将培养后的HUVEC以1×10⁵／ml的浓度接种于24孔板，待长成单层后，加入TNF-α50ng／ml为模型组；加入黄芩苷120μg／ml、60μg／ml、30μg／ml预处理24h后，再加入TNF—α50ng／ml为黄芩苷高、中、低剂量组；并设立不加任何刺激物者为正常组；正常细胞加黄芩苷组，每组设4个复孔。放置37℃、5％CO₂的培养箱内培养24h。上述24孔板内的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，加入鼠抗人CD54、CD106RPE，每管均设立同型对照，暗箱孵育25min后，流式细胞仪检测。结果CD54以平均荧光强度，CD106以荧光百分比表示。4．脂多糖（LPS）和佛波酯（PMA）对HUVEC表达CD106的影响将培养后的HUVEC以1×10⁵／ml的浓度接种于24孔板，待长成单层后，分别加入5个不同浓度的LPS、PMA，依次为80μg／ml、40μg／ml、20μg／ml、10μg／ml、5μg／ml；并设立不加任何刺激物者为正常组，每组设4个复孔。放置37℃、5％CO₂的培养箱内培养24h。上述24孔板内的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，加入鼠抗人CD106RPE，每管均设立同型对照，暗箱孵育25min后，流式细胞仪检测。结果CD106以荧光百分比表示。5．TNF-α对HUVEC凋亡的诱导作用培养后的HUVEC以1×10⁵／ml的浓度接种于24孔板，待长成单层后，加入5个不同浓度的TNF-α，依次为400ng／ml、200ng／ml、100ng／ml、50ng／ml、25ng／ml，并设立不加任何刺激物者为正常组，分别培养24h。上述24孔板内的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，按Annexin／PI试剂盒的说明书处理细胞后，流式细胞仪检测凋亡率，结果以凋亡百分率表示。6．流式细胞仪检测细胞凋亡率培养后的HUVEC以1×10⁵／ml的浓度接种于24孔板，待长成单层后，加入TNF-α100ng／ml为模型组；加入黄芩苷120μg／ml、60μg／ml、30μg／ml预处理24h后，再加入TNF-α为黄芩苷高、中、低剂量组；并设立不加任何刺激物者为正常组；正常细胞加黄芩苷组，每组设4个复孔。放置37℃、5％CO₂的培养箱内培养24h。上述24孔板内的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗后，按Annexin V／PI试剂盒的说明书处理细胞后，流式细胞仪检测凋亡率，结果以凋亡百分率表示。7．统计方法采用SPSS11．0软件包的方差分析（ANOVA）模块进行数据分析，多组间两两比较采用LSD法。抑制率=（1—实验组／对照组）×100％结果1．在倒置显微镜下观察HUVEC为贴壁细胞，呈三角形、多角形、梭形或多边形，“铺路石”样紧密镶嵌排列。感染TNF-α24h后，倒置显微镜下观察细胞形态未见明显改变。2．TNF-α刺激24h的HUVEC细胞增殖，与正常组比较有降低的趋势，但无统计学差异；单独黄芩苷（120μg／ml）对正常细胞的增殖无影响；黄芩苷高剂量对HUVEC的增殖有促进作用，促增殖率为16％，且P＜0.05。3．TNF-α刺激24h的HUVEC表面黏附因子CD54的平均荧光强度增加约1.6倍，单独黄芩苷（120μg／ml）组对正常细胞的CD54无影响；黄芩苷高剂量、中剂量组可有效降低TNF-α诱导的CD54的表达，抑制率分别为41％、15％。TNF-α对HUVEC表面黏附因子CD106的表达无明显影响。4．LPS、PMA刺激24h的HUVEC表面黏附因子CD106的荧光百分比，与正常组比较无差别。5．TNF-α可诱导HUVEC凋亡，在浓度为100 ng／ml，作用时间24h时，凋亡率最高，为正常组的约2.4倍。6．黄芩苷高剂量组可抑制TNF-α诱导的凋亡率的增加，抑制率为38％。结论TNF-α刺激HUVEC后，细胞表面黏附因子CD54增加，细胞凋亡率亦明显增加，但对CD106的表达无明显影响。说明TNF-α对内皮细胞的损伤作用一方面是诱导细胞膜表面黏附因子（CD54）的表达增加，另一方面可能与直接诱导细胞凋亡有关。LPS和PMA对CD106的表达也无明显影响。中药黄芩苷对TNF-α诱导的黏附因子表达有一定的抑制作用，同时对TNF-α诱导的凋亡率增加也有降低效果，体现了黄芩苷在抗炎、抗凋亡方面的作用。本研究从黏附因子、细胞凋亡两个方面，采用流式细胞术、MTT法，探讨了TNF-α对血管内皮细胞的损伤作用，为AS的慢性炎症学说提供了细胞学实验依据。黄芩苷降低TNF-α诱导的血管内皮表达黏附因子的分子途径，及抑制内皮细胞凋亡的信号通路，还需要做深入研究工作。