研究背景及目的：　　 自身免疫学机制在心力衰竭的发生发展中具有不可忽视的作用。已有的临床和基础研究发现,心衰患者血清中存在着抗β1-肾上腺素受体细胞外第二环的自身抗体(β1-AA);该自身抗体具有类β1-肾上腺素受体(β1-AR)激动剂样的作用,长期存在可诱导动物心功能不全,同时伴随T淋巴细胞系统功能紊乱。由于T淋巴细胞表面具有β1-AR,故理论上β1-AA可以与其结合,进而激活T淋巴细胞,但缺乏直接的实验依据。本研究试图从分子和细胞水平探讨β1-AA对T淋巴细胞功能改变的特点;从整体水平探讨T淋巴细胞在β1-AA致心功能不全中的意义,以加深对β1-AA致心功能不全机制的理解,为临床诊断、治疗β1-AA阳性的心衰患者提供实验依据。　　 研究方法：　　 1.材料的制备　　 1)抗原肽段的合成　　 根据人β1肾上腺素受体细胞外第二环(β1-AR-ECⅡ)的氨基酸序列,合成纯度大于95%的两条抗原肽段(肽段一:HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC,肽段二:CHWWRAESDEARR)。　　 2)单克隆抗体的制备　　 使用上述合成的两条抗原肽段共同免疫小鼠,采用杂交瘤细胞融合的方法制备β1-AA单克隆抗体,并用ELISA、Westernblot及激光共聚焦技术检测β1-AA单克隆抗体与细胞表面β1-AR的结合,乳鼠心肌细胞跳动频率实验评价β1-AA单克隆抗体的功能。　　 2.临床样本的收集　　 收集扩张型心肌病心衰患者的血清,用SA-ELISA方法检测血清中的β1-AA,利用IgGs亲和纯化试剂盒分别提取β1-AA阳性IgG及阴性IgG;收集β1-AA阴性心衰患者及健康人的抗凝静脉血,分离T淋巴细胞。　　 3.离体实验　　 采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离健康人及心衰患者外周血单个核细胞,进而用流式细胞分选技术分选CD3+T淋巴细胞;激光共聚焦检测来自心衰患者血清中的β1-AA与人CD3+T淋巴细胞表面β1-AR的共定位;采用CCK-8法及CFSE染色法检测T淋巴细胞的增殖;ELISA试剂盒测定T淋巴细胞cAMP的水平,以及IL-4、IFN-γ的含量;Westernblot分析VASP及p38MAPK蛋白的表达;AnnexinV/PI双染法经流式检测细胞凋亡的情况。　　 4.在体实验　　 4.1BalB/c小鼠和T淋巴细胞缺失的BalB/c裸鼠β1-AA被动免疫模型的建立:选择12周龄健康BalB/c小鼠和BalB/c裸鼠,经SA-ELISA法检测血清β1-AA呈阴性的动物作为免疫对象,实验分为四组:　　 ①BalB/c小鼠β1-AA组(n=18):β1-AA单克隆抗体　　 ②BalB/c小鼠对照组(n=18):生理盐水　　 ③BalB/c裸鼠β1-AA组(n=18):β1-AA单克隆抗体　　 ④BalB/c裸鼠(n=18):生理盐水　　 将β1-AA单克隆抗体按5μg/g体重剂量经腹腔注射注入BalB/c小鼠或BalB/c裸鼠,每2周加强免疫一次,共免疫12周;对照组以生理盐水替代β1-AA单克隆抗体。　　 4.2采用超声的方法动态检测β1-AA被动免疫BalB/c小鼠和BalB/c裸鼠的心功能;HE染色及Masson染色观察BalB/c小鼠和BalB/c裸鼠心肌组织形态的改变;ELISA试剂盒检测BalB/c小鼠和BalB/c裸鼠血清中BNP的含量;速率法检测血清中CKMB、LDH及AST的水平。　　 研究结果：　　 1.心衰患者血清中的β1-AA可以通过与β1-AR结合促进人CD3+T淋巴细胞增殖/凋亡,其途径可能与β1-AR-cAMP-PKA/p38MAPK通路有关;在增殖的T淋巴细胞中Th2细胞的分泌功能增强,而Th1细胞的分泌功能减弱。以上结果提示β1-AA可以直接作用于T淋巴细胞而诱导其功能发生改变。　　 2.心衰患者血清中的β1-AA可促进未服用p受体阻断剂的心衰患者T淋巴细胞增殖;在增殖的T淋巴细胞中Thl细胞的分泌功能减弱,但与正常T淋巴细胞不同的是,β1-AA对心衰患者Th2细胞的分泌功能并无影响;将来自心衰患者血清中的β1-AA与心衰患者T淋巴细胞孵育后的上清液,加入正常大鼠心肌细胞,可使后者发生损伤。以上离体实验结果提示,存在于心衰患者血清中的β1-AA有可能通过激活T淋巴细胞而导致心肌细胞损伤。　　 3.与BalB/c小鼠相比,β1-AA的长期存在对T淋巴细胞缺失的BalB/c裸鼠的损伤作用明显减弱,具体表现为:①心肌损伤的血清学指标显著下降(BNP:255.155±69.50vs.111.250±55.28pg/ml,P＜0.01;CKMB:495.67±6.13vs.208.67±53.21U/L,P＜0.01):②心功能明显改善(EF:28.705±7.76vs.38.296±9.16,P＜0.05;FS:13.45±3.91vs.20.60±9.83(BalB/c裸鼠),P＜0.05);③心肌重构明显减轻。这一结果强烈提示,T淋巴细胞在β1-AA致心功能不全的过程中发挥了重要作用。　　 结论：　　 存在于心衰患者血清中的β1-AA可以直接激活T淋巴细胞系统,进而导致心肌重构和心功能不全的发生。我们的研究结果不仅有助于加深对β1-AA致心力衰竭发生过程中自身免疫机制的理解,并为相关疾病的临床治疗和预后判断提供实验依据。