第一部分分区式组织工程脊髓修复大鼠T8脊髓缺损伤模型研究目的：探讨分区式导管（partition-type tube scaffold，PtTS）联合骨髓基质干细胞（bonemarrow stromal cells，BMSCs）组建分区式组织工程脊髓，在大鼠T8脊髓5mm全横断损伤模型中的修复效果。方法：Ⅰ、体外实验1.体外培养、传代大鼠来源的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的BMSCs。2.以壳聚糖和甲壳素为主要原料制备PtTS和单通道导管（hollow tubescaffold，HTS）。3.制备组织工程脊髓导管浸提液，用于BMSCs体外培养，CCK8法检测BMSCs与组织工程脊髓导管材料的生物相容性。4.光镜观察BMSCs在PtTS上的生长情况。Ⅱ、体内实验1.实验动物分组：SD大鼠随机分为6组，其中HTS组、PtTS组、HTS+BMSCs组和PtTS+BMSCs组，分别采用不同的方式来桥接修复大鼠T8脊髓节段5mm缺损；另设缺损组和假手术组作为对照组；分笼饲养12M后进行各项指标观察。2.行为学检测：各组大鼠分别于术前、术后1w、2w、4w、6w、8w、10w、12w、6M、9M、12M进行BBB行为学评分和CatWalk自动定量步态分析。3.运动诱发电位（motor evoked potentials，MEPs）检测：利用全功能肌电图诱发电位仪，将刺激电极分别置于大脑皮层或损伤下段（约T10节段）皮下，记录电极置于腓肠肌内，测定各组大鼠MEPs，对潜伏期和振幅进行统计学分析。4.红核脊髓束（rubrospinal tract，RST）顺行示踪：取材前2w利用脑立体定位仪将Fluoro ruby（FR）注射入红核中心部位，观察各组脊髓损伤区域RST生长情况。5.免疫荧光组织化学染色：取C4到L4节段脊髓组织进行5-HT1A和NF免疫荧光组织化学染色，观察神经纤维再生和BMSCs分化情况；计算各组距离损伤中心不同节段脊髓中的阳性神经纤维数目与假手术组的比例，进行统计学分析。6. Western blot检测：取各组脊髓损伤中心至头端和尾端均为3mm范围内的脊髓组织，提取蛋白检测5-HT1A和NF蛋白的表达情况。7.电镜观察：取各组脊髓损伤中心的再生组织进行电镜观察，计算有髓神经纤维的数目和髓鞘厚度并进行统计学分析。结果：Ⅰ、体外实验1. BMSCs的体外培养：对BMSCs进行体外培养，传代6次后，荧光显微镜下观察其GFP荧光标记率仍达90%左右。2.组织工程脊髓导管的制备：成功制备PtTS和HTS。3. BMSCs与组织工程脊髓导管的相容性检测：CCK8法检测细胞增殖曲线，结果显示随培养时间延长，BMSCs数量持续增多，第3d到达平台期；光镜观察，BMSCs在导管腔面黏附生长，状态良好。Ⅱ、体内实验1.术后动物一般情况观察：术后12M除假手术组外，其余各组大鼠后肢肌肉有不同程度的萎缩，脊柱有不同程度的弯曲，其中PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组大鼠相对其余各组较好。2.行为学检测：（1）BBB评分：术后各手术组大鼠评分均降至0分，然后逐步上升；从术后10w到12M，PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组明显高于HTS组、PtTS组和缺损组，差异有统计学意义；后3组间无显著性差异。（2）步态规律的规律指数：术后各手术组均明显下降，2w后开始缓慢上升；PtTS+BMSCs组在8w后明显高于其他4个手术组，差异有统计学意义；HTS+BMSCs组也明显高于缺损组，且除了第6M外，在其余时间点均高于HTS组和PtTS组； HTS组、PtTS组和缺损组之间无显著性差异。（3）支座距离：术后各手术组均增加至50mm以上，2w后开始缓慢下降；PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组明显小于HTS组、PtTS组和缺损组，差异有统计学意义。（4）后足压强：术后各手术组均明显下降；4w后PtTS+BMSCs组开始稳定上升，高于其余4个手术组，差异有统计学意义；12w后HTS+BMSCs组明显升高；HTS组、PtTS组和缺损组在整个测试期间维持较低水平。（5）摇摆时间：整个测试期间，各手术组均有明显波动，总体呈下降趋势，各组间无显著性差异。3. MEPs检测：除缺损组外其余各组大鼠在大脑皮层刺激和在损伤下段刺激时，均能在腓肠肌记录到MEPs波形。在大脑皮层刺激时，PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组的潜伏期与HTS组和PtTS组相比较短，且PtTS+BMSCs组的振幅大于HTS组、PtTS组和HTS+BMSCs组，差别有统计学意义；在损伤下段刺激时，各手术组的潜伏期无显著性差异，但PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组的振幅大于HTS组、PtTS组和缺损组，差别有统计学意义。4.脊髓大体观察：缺损组脊髓两残端明显萎缩，距离大于5mm；其余各手术组导管与脊髓两残端在解剖结构上出现了不同程度的连续性，导管部分降解；其中PtTS+BMSCs组和HTS+BMSCs组的导管和脊髓连接较好。5. RST顺行示踪：PtTS+BMSCs组损伤尾侧段可见FR阳性神经纤维，聚集成束，排列规则，大多集中分布在导管RST分区位置。6.5-HT1A+神经纤维再生情况：各组导管都有不同程度的降解；PtTS+BMSCs组和PtTS组的5-HT1A+神经纤维排列规则，前者再生区域内阳性神经纤维较多，部分BMSCs显示5-HT1A和GFP双标阳性；HTS+BMSCs组和HTS组中5-HT1A+神经纤维排列不规则。对5-HT1A+神经纤维进行统计学分析结果显示，从损伤中心分别往头端和尾端3mm的范围内，PtTS+BMSCs组的5-HT1A+神经纤维多于其余4个手术组；从损伤中心往头端2mm的区域、以及距离损伤中心3mm的尾端区域内，HTS+BMSCs组多于HTS组、PtTS组和缺损组；差别均有统计学意义。Westernblot结果显示各组5-HT1A蛋白表达水平与免疫荧光组织化学染色结果相一致。7. NF+神经纤维再生情况：PtTS+BMSCs组的导管大部分降解，在再生区域中可见NF+神经纤维排列整齐，跨越缺损处；较多的BMSCs显示GFP和NF双标阳性，散在分布于神经纤维之中。对NF+神经纤维进行统计学分析结果显示，从损伤中心分别往头端和尾端3mm的范围内，PtTS+BMSCs组的NF+神经纤维多于其余4个手术组，HTS+BMSCs组多于HTS组、PtTS组和缺损组，差别有统计学意义。Western blot结果显示各组NF蛋白表达水平与其免疫荧光组织化学染色结果相一致。8.电镜观察髓鞘形成情况：缺损组损伤中心仅有胶质疤痕组织，未见新生轴突；HTS组和PtTS组可见少量散在分布的轴突，部分裸露，髓鞘未形成完全；HTS+PtTS组和PtTS+BMSCs组可见较多的有髓神经纤维和毛细血管，后者轴突排列整齐，髓鞘板层结构清晰，并有突触可见。PtTS+BMSCs组的有髓神经纤维的数目多于HTS组、PtTS组和HTS+BMSCs组，HTS+BMSCs组多于PtTS组和HTS组，差别均有统计学意义；但HTS组和PtTS组之间无显著性差异。各手术组有髓神经纤维的髓鞘厚度未见显著性差异。结论：组织工程脊髓导管与BMSCs相容性良好；利用PtTS联合BMSCs对大鼠脊髓损伤进行修复，与HTS+BMSCs组、PtTS组和HTS组相比，大鼠运动功能恢复更好；各桥接组下行运动神经通路的电生理特性均得到部分恢复；PtTS与HTS相比，能更好的引导损伤区域内的再生神经纤维有序生长、规则排列；移植的BMSCs可以部分分化为神经元，促进轴突再生；PtTS联合BMSCs的治疗方案能更好的促进脊髓损伤后的有髓神经纤维再生，并引导其有序生长，与损伤尾侧端建立功能联系，为治疗脊髓损伤提供具有潜在意义的组合方案。第二部分分区式组织工程脊髓对大鼠脊髓损伤后神经组织的细胞凋亡的影响目的：了解分区式组织工程脊髓中BMSCs在SCI后神经组织的细胞凋亡发生中的影响，探讨其修复神经损伤、促进功能恢复的作用机制。方法：1.实验动物分组：SD大鼠随机分为4组，其中BMSCs组（PtTS+BMSCs），PBS组（PtTS+PBS），z-VAD-fmk组（PtTS+z-VAD-fmk），分别采用不同方式来桥接修复大鼠T8脊髓节段5mm缺损；另设假手术组作为对照组；分笼饲养3w后进行各项指标观察。2.行为学检测：各组大鼠分别于术前、术后3d、7d、14d、21d进行BBB行为学评分和CatWalk自动定量步态分析。3. TUNEL检测：术后1w、2w、3w分别取各组大鼠T7节段脊髓进行TUNEL染色，对阳性细胞数进行统计学分析，观察各组脊髓组织细胞凋亡情况。4.电镜观察：取各组大鼠T7节段脊髓进行电镜检测，观察各组神经组织细胞的超微结构。5.免疫荧光组织化学染色：取各组大鼠T7节段脊髓进行冰冻切片后行下述染色（1）完成TUNEL染色后进行NeuN免疫荧光组织化学染色，对脊髓灰质前角TUNEL+神经元进行统计学分析，观察神经元的凋亡情况。（2）完成TUNEL染色后分别进行CNPase和GFAP免疫荧光组织化学染色，对脊髓白质中TUNEL+的少突胶质细胞和星形胶质细胞分别进行统计学分析，观察神经胶质细胞的凋亡情况。（3）进行NeuN/caspase-3免疫荧光组织双标化学染色，观察并统计脊髓灰质前角神经元表达caspase-3的情况。（4）进行CNPase/caspase-3、GFAP/caspase-3免疫荧光组织双标化学染色，观察并统计脊髓少突胶质细胞和星形胶质细胞表达caspase-3的情况。6. Western blot检测：取各组大鼠损伤中心至头端和尾端均为3mm范围内的脊髓组织，提取蛋白检测caspase-3p17、PARP和cleave PARP蛋白的表达情况，观察各组脊髓caspase途径蛋白的表达变化。结果：1. TUENL染色：术后假手术组未见明显细胞凋亡，其余3组术后1w可见大量TUNEL+细胞，3组间未见显著性差异；术后2w开始，BMSCs组和z-VAD-fmk组的TUNEL+细胞少于PBS组，差异有统计学意义；对每组不同时间点的TUNEL+细胞进行比较，BMSCs组和z-VAD-fmk组在术后3w比术后1w明显减少，差异有统计学意义，而PBS组未见明显降低。2.电镜观察：BMSCs组中有较多有髓神经纤维，凋亡细胞较少；z-VAD-fmk组中有髓神经纤维数目减少，神经组织细胞或为形态正常或发生坏死；PBS组中神经纤维密度明显降低，可见较多凋亡细胞和坏死细胞，轴突发生脱髓鞘现象。3.神经元的凋亡情况：假手术组中NeuN+神经元未见TUNEL阳性反应，且神经元数目多于其余3组；BMSCs组和z-VAD-fmk组的NeuN+/TUNEL+双阳性细胞数少于PBS组；差异均有统计学意义。4.少突胶质细胞的凋亡情况：各组CNPase+少突胶质细胞数目无显著性差异；假手术组中CNPase+细胞未见TUNEL阳性反应；比较各组CNPase+/TUNEL+细胞数，z-VAD-fmk组少于PBS组，差异有统计学意义；BMSCs组和PBS组之间、以及BMSCs组与z-VAD-fmk组之间无显著性差异。5.星形胶质细胞的凋亡情况：各组GFAP+星形胶质细胞数目无明显差异。除假手术组中GFAP+细胞未见TUNEL阳性反应外，其余3组均可见GFAP+/TUNEL+细胞，但细胞数无显著性差异。6. caspase-3在神经元中的表达情况：BMSCs组中caspase-3+/NeuN+细胞数少于PBS组，差异有统计学意义；z-VAD-fmk组和假手术组中未见NeuN+神经元表达caspase-3。7. caspase-3在少突胶质细胞中的表达情况：BMSCs组中caspase-3+/CNPase+细胞数少于PBS组，差异有统计学意义；z-VAD-fmk组和假手术组中未见CNPase+少突胶质细胞表达caspase-3。8. caspase-3在星形胶质细胞中的表达情况： BMSCs组和PBS中caspase-3+/GFAP+细胞数无显著性差异；z-VAD-fmk组和假手术组中未见GFAP+星形胶质细胞表达caspase-3。9. caspase途径蛋白的表达情况：比较各组与caspase途径相关的caspase-3p17、PARP和cleave PARP蛋白的表达情况，BMSCs组的caspase-3p17和cleavePARP蛋白表达高于z-VAD-fmk组和假手术组，但低于PBS组，差别均有统计学意义。10.行为学检测：（1）BBB评分：术后除假手术组维持在21分外，其余各组大鼠评分均降至0分，然后逐步上升；术后14d开始，BMSCs组与z-VAD-fmk组评分高于PBS组，差异有统计学意义；PBS组评分进入平台期。（2）步态规律的规律指数：术后除假手术组维持在95%以上外，其余各组均下降至10%左右，然后缓慢上升，术后3w内各手术组间无显著性差异。（3）支座距离：术后除假手术组维持在30mm左右外，其余各组均增加至50mm以上；术后2w开始，BMSCs组和z-VAD-fmk组下降接近于假手术组，且明显低于PBS组，差异有统计学意义。（4）后足压强：术后除假手术组维持在100a.u以上外，其余各组均明显下降；术后2w开始，BMSCs组和z-VAD-fmk组高于PBS组，差异有统计学意义。（5）摇摆时间：术后除假手术组没有明显改变外，其余各组均有所增加；术后1w开始，BMSCs组和z-VAD-fmk组低于PBS组，差异有统计学意义；术后2w开始，BMSCs组和z-VAD-fmk组接近于假手术组，3组间无显著性差异。结论：分区式组织工程脊髓中的BMSCs能通过阻止caspase-3的表达，抑制caspase介导的细胞凋亡途径，减少脊髓损伤后神经元和少突胶质细胞的凋亡发生，更好的促进大鼠运动功能恢复；脊髓损伤后星形胶质细胞的凋亡与caspase途径无直接相关，可能主要通过其他途径导致凋亡发生。