真菌毒素是一类具有极强毒性的真菌次级代谢产物,广泛存在于各类食物及饲料中,严重危害着人类和动物的生命安全与健康。目前,高效液相层析法和气相色谱-质谱联用分析法在真菌毒素分析检测中应用最为广泛,这两种方法虽然具有很好的灵敏度和较低的最低检出限(LOD),但是需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作流程、专业的技术人员等,严重制约了它们在食品日常检测中的应用。为了获得便捷高效、高灵敏度、高特异性、成本低廉的真菌毒素检测技术,科研工作者们提出了多种解决方案,其中包括应用纳米粒子对能够识别待测毒素的抗体或是适配体进行标记,通过多种检测手段,实现对真菌毒素的检测。然而现有的检测方法很难满足在保有一个较宽检测范围的同时,获得一个极低的检出限。为应对这一挑战,本课题设计开发了两种基于纳米金的适配体传感器,通过优化设计思路,充分发挥纳米材料及核酸适配体所具备的特性,实现对真菌毒素的快速、灵敏、低成本的检测。本课题的主要研究内容及结果如下:1.基于纳米金构建用于AFB1检测的适配体传感器纳米金胶体在520nm左右有一特征吸收峰。本实验通过将AFB1核酸适配体修饰于纳米金表面来获得探针。检测时,预先将待测液与一定浓度的AFB1-BSA混合,然后将上述纳米金探针加入该混合体系。若待测液中没有AFB1,纳米金表面的AFB1适配体则会与BSA上的AFB1特异性结合,由于一个BSA分子上标记有多个AFB1,从而引发纳米金聚沉现象,纳米金在特征峰处吸收强度下降。反之,待测液中的游离AFB1会与BSA-AFB1形成竞争,抑制纳米金聚沉和特征吸收峰的降低。本体系中,根据纳米金的特征峰吸收与待测AFB1浓度的相关性,实现对未知浓度的AFB1的检测。线性检测范围为10 pg m L-1至1μg m L-1,最低检测限为4.1 pg m L-1。2.基于FRET现象构建高灵敏OTA适配体传感器FRET适配体传感器包括一个未经修饰的OTA适配体作为识别探针,OTA适配体部分互补链修饰的金纳米粒子(互补链末端修饰有生物素,生物素-互补DNA-金纳米粒子)作为能量受体,和一个经Cy3标记的链霉亲和素作为能量供体。该适配体传感器用于检测OTA时,适配体与其互补链分离,与OTA特异性结合,修饰于互补链末端的生物素暴露于链霉亲和素,通过生物素和链霉亲和素之间的特异结合,Cy3汇集于纳米金表面从而实现FRET。本体系中,随着OTA浓度的逐渐增大,Cy3的发射光强度随之下降。在优化条件下,OTA的线性检测范围为2.5 pg m L-1至1μg m L-1,最低检测限可达1.4 pg m L-1。3.核酸适配体传感器的选择性和特异性评价我们将常见的FB1、DON作为干扰毒素,另将AFB1与OTA互为干扰毒素,分别加入检测体系,评价上述两种适配体传感器对于非目标物的特异性和选择性。结果显示,上述两种适配体传感器仅对目标物表现出特异性响应,表明它们均具有良好的选择性和特异性。4.选择小麦提取物及绿咖啡提取物作为模拟样品,评价OTA适配体传感器在实际应用中的潜力为验证OTA适配体传感器是否能应用于实际检测中,我们分别提取了小麦与绿咖啡的浸取液,并向其中加入已知浓度的OTA标准品,然后用所开发的适配体传感器对其进行检测。实验结果显示:尽管在本模拟体系中所获得的最低检出限稍高于实验室条件下所得到的最低检出限,但仍然远远低于国家标准所规定的最大容许浓度,证实了上述两种传感器在实际检测中的应用潜力和可行性。综上所述,本课题中我们充分发挥纳米金和核酸适配体的特性,开发了两种应用于真菌毒素检测的光学传感器,在缓冲液中实现了AFB1和OTA的快速、灵敏、低成本检测分析,同时OTA适配体传感器在模拟样品中也收到出色结果。本课题不仅为真菌毒素检测提供了灵敏有效的检测方法,同时也为其他小分子检测提供了新思路。