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柑橘皮渣是柑橘加工副产物,三峡库区每年约产生1.05×106吨柑橘皮渣,其水分和糖分含量都很高,容易腐烂变质,长期保存比较困难,大量柑橘皮渣随意丢弃,严重污染环境。柑橘皮渣营养丰富,是制作青贮饲料的优良原料。现有青贮方式以地下式或半地上式为主,规模大,密封性差,加之三峡库区夏秋季以高温度、高湿度、高降雨量为主,空气中的水分和地表径流混杂腐败微生物极易污染青贮饲料。加之,以柑橘皮渣为原料的饲料品质在青贮池内的空间变化规律以及机理尚不清楚,这严重制约了饲料品质的改善以及青贮技术的推广应用。为了将柑橘皮渣废弃物变废为宝,改进现有粗犷的青贮方式,降低蛋白质水解程度,提高青贮饲料品质,本论文以柑橘皮渣、少量麸皮和菜叶为青贮原料,研究青贮过程中微生物群落结构以及物质组成在时间尺度和空间尺度上的变化规律,在此基础上,结合微生物群落结构的演替特征,解析饲料品质随时间和空间的变化机理;根据蛋白质组成及水解程度在青贮池内的空间变化特征,分析其他青贮因子对蛋白质水解的促进与抑制作用,解析饲料中蛋白质的水解机理;以斑马鱼为模式生物,建立青贮饲料食用安全性评价方法,评价青贮饲料的食用安全性。具体研究内容和结果如下:通过Illumina MiSeq测序技术,分析青贮饲料中微生物丰富度、多样性、群落组成和数量随时间和空间的变化特征,分析菌剂在青贮过程中的作用,通过微生物群落结构演替评价青贮进程。结果表明,自然青贮过程中,乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）在原料中的相对丰度不足1.00%,在青贮前3 d迅速增加至72.72%,最终丰度为92.70%,其中,Pediococcus呈现先增加后降低的趋势,最终丰度低于1.00%,Lactobacillus组成由OTU80变为OTU105和OTU108。腐败菌共涉及6个菌属,总相对丰度呈现出先增加后降低的变化趋势,最终样品中腐败菌总丰度为3.13%。在添加菌剂的青贮饲料中,LAB相对丰度之和较自然青贮至少增加了6.24%,从第3 d起,腐败菌即被很好地抑制,青贮结束时已检测不到腐败菌存在。对于添加菌剂A,Lactobacillus取代了unclassifiedfEnterobacteriaceae和norankcCyanobacteria,成为上层和下层的优势细菌属,相对丰度大于82.66%,unclassifiedoSaccharomycetales取代了unclassifiedfTrichocomaceae,成为上层和下层的优势真菌属,相对丰度大于81.12%,中间层细菌和真菌群落的变化趋势与上层和下层差异很大。对于添加菌剂B,Lactobacillus取代norankcCyanobacteria和norankfMitochondria成为整个青贮池中的绝对优势细菌属,相对丰度大于97.49%,并呈现出由上层至下层逐渐增加的趋势,unclassifiedfTrichocomaceae取代unclassifiedoSaccharomycetales成为整个青贮池中的优势真菌属,相对丰度大于34.76%,并由上层至下层逐渐增加,Saccharomycetaceae在青贮池内的总相对丰度低于25.91%,并由上层至下层逐渐降低,中间层真菌群落的变化趋势不同于上层和下层。菌剂的组成不同,微生物群落在青贮过程中的演替规律也随之不同。研究了青贮饲料中有机碳组成、有机氮组成、可培养微生物数量随时间和空间的变化特征,定量分析了青贮饲料物质组成、微生物群落结构与环境因素之间的关系,解析青贮饲料物质组成变化的机理,探索改善青贮饲料品质的方法。结果表明,在前3 d到6 d,好氧微生物利用原料中的水溶性有机碳（Water soluble carbohydrates,WSC）、溶解性蛋白（Soluble protein,SP）以及残留的氧气进行新陈代谢,产生大量的酶,粗纤维（Crude fiber,CF）、果胶和蛋白质在酶的作用下快速降解,导致WSC、SP、总水溶性氨基酸（Total water soluble amino acid,TWSAA）含量在青贮前期先降低后增加,LAB将WSC转化为有机酸,pH在青贮初期迅速降低,pH的降低以及残留氧气的消耗又抑制了好氧微生物的生长,导致酶的分泌量减少,CF、果胶和蛋白质的降解变慢,总碳（Total carbon,TC）、粗蛋白（Crude protein,CP）以及干物质（Dry matter,DM）的损失率都趋于平稳,到第34 d时物质含量基本稳定。自然青贮过程中有机酸的产生是多种微生物共同作用的结果,A组和B组中Lactobacillus主导了pH的降低。自然青贮中蛋白质降解率最高,有0.32%的蛋白质被降解为TWSAA,同时有0.25%的蛋白质被彻底降解为NH3-N。Weissella和Clostridiumsensustricto1是导致其蛋白质降解率高的主要原因。添加青贮菌剂可以提高青贮饲料品质,且青贮34 d以后即可开窖取用。添加菌剂A的青贮饲料中,pH值呈现出从上层到下层,从外层到中心逐渐降低的趋势,WSC含量呈现出由上至下逐渐降低的趋势。SP含量在中间层最低,而TWSAA含量在中间层最高;NH3-N含量则由上至下逐渐降低,说明中间层中有较多的SP转化为TWSAA。CF、果胶以及CP降解率均呈现由上层至下层逐渐降低的趋势,导致DM损失率也呈现出由上至下逐渐降低的趋势。饲料位置越靠下,饲料品质越好。unclassifiedoSaccharomycetales和norankoEurotiales在CF和果胶的降解中起主要作用。Sphingobium、Brevundimonas和真菌在CP的降解中起主要作用。中间层中TWSAA含量最高是由于Sphingobium和Brevundimonas水解更多的SP所致。有机酸的产生以及pH的降低是Lactobacillus和Pediococcus在青贮过程中引起的。上层中异型LAB总比例（>87.92%）高于中间层和下层,导致T1中乙酸（Acetic acid,AA）含量显著高于其他两层。虽然中间层LAB总相对丰度最低,但其中同型LAB占LAB总量的92.87%,其生产乳酸（Lactic acid,LA）的能力并没有被影响。温度、含水率和pH值的空间变化抑制了原料中腐败菌并促进了青贮过程中的有利菌的生长。微生物群落组成和环境因素共同决定了青贮饲料的品质。为了提高青贮饲料的质量,应该增加青贮池上部LAB的添加量。系统地分析了青贮饲料蛋白质水解程度,定量分析不同因素对青贮过程中蛋白水解的促进和抑制作用,解析蛋白质水解抑制与促进作用的成因,最后,提出降低青贮饲料中蛋白质水解程度的有效方案。结果表明,添加菌剂B的青贮饲料中,由上层至下层平均pH、DM损失率、TC损失率、CP损失率分别小于3.74、8.33%、8.72%、17.39%,说明青贮成功,但CP损失率较高。饲料蛋白质由SP、不溶性蛋白（Insoluble protein,ISP）、TWSAA、NH3-N组成,青贮过程中,SP和ISP含量降低,NH3-N含量增加,上层和下层中SP含量分别降低了35.01%和35.84%,上层和下层中ISP含量分别降低了11.82%和10.45%,上层和下层中NH3-N含量分别增加了93.33%和22.54%。中间层中SP和ISP的损失率最大,分别为56.26%和14.34%,同时,NH3-N的增加率也最大为129.21%。上层和中间层中TWSAA含量降低,损失率分别为1.42%和12.07%,下层中TWSAA含量升高,增加率为11.24%,中间层TWSAA损失率最高。微生物群落结构的演替诱导了饲料物质组成的变化,导致了饲料A和B成分的差异。酸性蛋白酶（Acid protease,AP）主要为微生物蛋白酶,可以耐受3.44-3.77的pH范围,既主导CP和SP的水解,也主导TWSAA的水解,pH的降低、WSC、LA以及AA的增加对AP活性有显著的促进作用,而含水率的增加、TC和DM的损失则对AP活性有抑制作用。蛋白质水解第一阶段主要受AP活性的影响,含水率的增加、TC、DM的损失促进了蛋白质水解的第二阶段,而WSC、LA以及AA的增加、pH的降低则抑制了蛋白质水解的第二阶段。B-CC、OTU75和OTU41促进了AP的产生和活性,B-CC、OTU75、F-CC促进了蛋白质水解第一阶段,OTU43、F-CC促进了蛋白质水解第二阶段,B-CC、OTU75则抑制了TWSAA的水解。中间层中蛋白水解作用最强,因为其B-CC（OTU315和OTU317）与F-CC（OTU9、OTU72和OTU100）的相对丰度均不同于其他两层,导致了蛋白质水解程度最高。降低饲料蛋白质水解程度的主要措施是增加原料中同型LAB浓度,尤其是中间层。以斑马鱼为受试生物建立了青贮饲料食用安全性评价方法,向斑马鱼投喂不同浓度青贮饲料,检测斑马鱼生长发育指标、主要脏器和组织的健康状态、肠道免疫能力等的变化,分析柑橘皮渣青贮饲料的食用安全性。结果表明,喂食量为0.2%体重时,可以降低斑马鱼的致死率,不管饲喂高浓度饲料还是低浓度饲料都不会影响斑马鱼肥满度,不会阻碍斑马鱼肠道发育的完整性。但是,喂食量为2%体重时,提高了斑马鱼的致死率,降低了饲料转化率并导致斑马鱼排泄物过多,抑制了斑马鱼体长、体重增长,性腺发育及雄鱼肝脏发育,降低了斑马鱼血糖浓度和肌肉组织蛋白质含量。青贮饲料在调节斑马鱼肠道微生物群落结构中起到了积极作用,显著抑制了致病菌Vibrio的丰度,并提高了物种多样性,但喂食量为2%体重时,会降低肠道重量,导致致病菌Aeromonas相对丰度增加,降低肠道系统免疫能力,增加了斑马鱼感染疾病的风险。柑橘皮渣青贮饲料在畜禽日粮中的添加量以0.2%体重为宜。