骨缺损是战争中常见的损伤,可由子弹、爆炸物碎片、冲击波或爆炸直接损伤等因素所引起。由于创伤严重、易于感染等特点,如果未能得到及时修复或修复不佳,将导致骨不连、骨延迟愈合等,给病患者带来疼痛和功能丧失。针对骨缺损的治疗,目前的主要手段是采取自体骨移植,但由于供体的缺乏及重新造成的损伤而限制了其广泛运用。虽然异体或异种骨移植避免了自体骨移植的不足,但会带来肝炎等疾病的传播。同时,战争时常在短时间出现大批伤员,异体骨的来源也是一个棘手的问题。近年来,组织工程化人工骨成为很有希望的骨组织替代品。其核心成分主要包括支架材料、种子细胞和诱导信号。尽管相关的研究显示许多令人鼓舞的进展和希望,但由于火器性损伤的特殊性,损伤局部有血循环差、易感染等特点,目前的人工骨尚不能达到与自体骨移植相似的效果。为此本课题引入基因转染技术,用人血管内皮细胞生长因子121(human Vascular Endothelial Growth Factor 121, huVEGF121)基因对培养的骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cell,BMSCs)进行基因修饰,增加其合成及分泌成血管因子的水平,然后用huVEGF121基因修饰的BMSCs与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物制作的多孔支架材料结合,构建huVEGF121基因修饰复合材料,用于修复家兔桡骨火器性骨缺损,探讨火器性骨缺损治疗的替代方法及策略。本课题的研究主要包括以下三个部分,所取得的主要结果及结论如下:第一部分 家兔桡骨火器伤性骨缺损动物模型的建立及其局部血流灌注变化1、本研究首先用53式滑膛枪发射0.25g钢珠,探讨在射击距离5米情况下,制作家兔桡骨火器性骨缺损的适当条件,为下一步探讨其损伤特点和修复策略提供基础。结果表明,当投射物初速为550～600 m/s时,双骨折发生率低,骨折粉碎范围在1.0 cm左右,经清创后骨缺损约为1.2cm,动物能长期存活,符合下一步研究的需要。2、在此基础上,我们用印度墨汁灌注的方法观察了火器性骨缺损局部骨和肌肉不同时相点的血流灌注情况,结果表明,火器性骨缺损局部的骨折端和肌肉的血流灌注都明显减少。结果提示,在研究火器性骨缺损的修复时,改善血流灌注具有重要意义。 <WP=12>第二部分 携带huVEGF121基因的重组腺病毒载体构建1、用酶切法和测序法鉴定了pUC18-huVEGF121,保证了外源基因序列的正确性。2、分别构建了穿梭质粒pDC315-huVEGF121和带有报告基因的穿梭质粒pDC315-VEGF121-eGFP,分别用两种穿梭质粒与腺病毒基因组质粒共转染293细胞,获得两种重组腺病毒Ad-huVEGF121和Ad-huVEGF121-eGFP。3、采用PCR鉴定了两种重组腺病毒带有外源基因,空斑试验测定病毒液的滴度分别为1.0×1010~3.0×1011pfu/ml和3.0×1010~4.2×1011pfu/ml。4、用免疫组化法证明Ad-huVEGF121转染的3T3细胞能合成huVEGF121蛋白。荧光显微镜观察表明Ad-huVEGF121-eGFP转染的3T3细胞能合成huVEGF121-eGFP融合 蛋白。以上结果表明,我们构建的重组腺病毒载体含有目的基因,序列完整,阅读框架正确,效价高,能在真核细胞中表达,适用于基因治疗。第三部分 huVEGF121基因修饰复合材料的构建1、用密度梯度离心法分离并培养BMSCs,用条件培养基分别诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,表明该细胞是具有多向分化潜能的干细胞2、用Ad-huVEGF121-eGFP、Ad-huVEGF121和Ad-lacZ分别转染BMSCs,研究了病毒转染对细胞增殖、诱导分化、贴壁等生物特性的影响,结果表明,3种病毒转染对BMSCs的增殖、诱导分化、贴壁等生物学特性没有影响。3、用融媒溶解、颗粒滤取法制作了孔径在250-450um的PLGA多孔支架材料,测定孔隙率为86%左右。体外生物相容性研究表明,BMSCs能和该材料粘附,电镜下观察见细胞伸展良好。体内研究表明,该支架材料肌肉包埋条件下,早期诱发轻度非特异性炎症反应,2周时明显消退,说明该材料生物相容性良好。4、用Ad-huVEGF121-eGFP转染BMSCs,再将此细胞与多孔支架材料复合后植入体内,结果表明,外源基因在体内3周时明显减弱。5、用Ad-huVEGF121-eGFP转染骨BMSCs,体外培养4周后仍可见细胞内明显的绿色荧光。6、流式细胞仪测定表明,用Ad-huVEGF121-eGFP转染BMSCs的转染效率高,达到97.5%。 <WP=13>以上结果表明,BMSCs具有成骨分化等多向分化潜能,适于基因转染,与支架材料生物相容性好。我们构建的腺病毒载体对细胞的生物学特性没有明显的影响。外源基因转染BMSCs后,能在体内外表达一定的时间,适用于体内的修复研究。第四部分 huVEGF121基因修饰复合材料修复家兔桡骨火器性骨缺损的实验应用体外获取的huVEGF121基因修饰的BMSCs,结合PLGA多孔支架构建huVEGF121基因修饰的人工复合材料,通过该材料修复兔桡骨火器性骨缺损,并与修复手术制作的桡骨骨缺损进行比较,结果发现:1. 修复局部血流量和血流灌注:无论是手术骨缺损组还是火器性骨缺损组,huVEGF121基因转染都能提高局部的血流量和血流灌注,但两者具有不同的特点:在手术骨缺损组(S组,下同),转染huVEGF121基因组(SD亚组,下同)只在修复后72h和2周两个时相点局部血流量和血流灌注明显高于单纯支架材料组(SA亚组,下同)、支架材料加单纯细胞组(SB亚组,下同)以及支架材料加Ad-lacZ转染细胞组(SC亚组,下同)