巢式PCR方法检测卡氏肺孢子虫的研究

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目的:了解mtLSU-巢式PCR方法等3种方法检测大鼠肺组织和BALF标本卡氏肺孢子虫的敏感性,以及两种标本卡氏肺孢子虫检出率的差异性;明确巢式PCR方法应用于早期检测卡氏肺孢子虫的可行性;分析mtLSU rRNA和ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因序列与Genbank中的其他宿主源肺孢子虫的基因差异。方法:把大鼠随机分为7组(6组实验组,1组对照组),每组10只,采用地塞米松免疫抑制法诱导实验组大鼠感染肺孢子虫;自第3周开始每周剖杀1组实验鼠,收集第3周至第8周实验组大鼠肺组织和BALF标本。经六亚甲基四胺银(GMS)染色后采用镜检对3-8周大鼠肺组织和BALF标本进行检测;分别提取每份标本的基因组DNA,选取mtLSU rRNA和ITS1-5.8S rRNA-ITS2作为分子标记,对目的基因进行巢式PCR扩增,采用双向测序对PCR产物进行测序;从Genbank中检索不同宿主源的肺孢子虫基因序列,应用BLAST对基因序列进行比较并应用DNASTAR分析相似度和特异度,分析不同宿主来源肺孢子虫的同源性。将检测结果进行统计学分析,判定mtLSU-巢式PCR方法、ITS-巢式PCR方法和镜检法差异有无统计学意义。结果:采用GMS染色镜检法于第5周开始检出肺孢子虫包囊,第6、7周包囊数最多。采用mtLSU-巢式PCR方法和ITS-巢式PCR方法对实验感染大鼠肺组织和BALF进行检测,前者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3周100% (10/10)和100(10/10);第4周100%(10/10)和80%(8/10);第5周100%(10/10)和50%(5/10);第6周90%(9/10)和100%(10/10);第7周100%(10/10)和80%(8/10);第8周100%(8/8)和87.5%(7/8)。后者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3周20% (2/10)和0(0/10);第4周70%(7/10)和10%(1/10);第5周90%(9/10)和30%(3/10);第6周90%(9/10)和80%(8/10);第7周100%(10/10)和80%(8/10);第8周62.5%(5/8)和62.5%(5/8)。经x2检验,在大鼠无明显症状阶段(3-4周)时,mtLSU-巢式PCR方法检测的敏感性高于ITS-巢氏PCR方法,差异有统计学意义;有明显症状阶段(5-8周)时,两种方法敏感性差异无统计学意义。同时统计学分析显示不同方法对大鼠肺组织和BALF标本检出率不同,采用mtLSU-巢式PCR方法检测,肺组织和BALF标本卡氏肺孢子虫的检出率一致,差异无统计学意义,而采用ITS-巢式PCR方法检测,BALF卡氏肺孢子虫检出率低于肺组织,差异有统计学意义。所测Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU rRNA基因序列长度为155bp,与Genebank的大鼠源肺孢子虫(PCU20170)、西班牙人源肺孢子虫(DQ473446)、小鼠源肺孢子虫(AF257179)、猕猴源肺孢子虫(AY265389)和印度艾滋病病人(EF439815)的mtLSU rRNA基因序列进行对比,同源性分别为98.7%、98.7%、87.2%、76.6%和81.2%。所测ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因序列为520bp,与Gene Bank沙鼠源(AY875972)、兔源(DQ010098)、大鼠源(L27658)、人源(PCU07211)和小鼠源(AY532651)的ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因序列进行对比,同源性分别为72.4%、64.7%、83.1%、63.9%和75.7%,发现5.8S rRNA高度保守,而ITS1和ITS2基因序列变异较大,适合基因分型及系统分化研究。结论:mtLSU-巢式PCR方法是检测不同时期大鼠卡氏肺孢子虫3种方法中敏感性最好的方法,尤其是在PCP早期无症状阶段更为明显,检测BALF标本的卡氏肺孢子虫检出率与肺组织相同,提示mtLSU-巢式PCR方法可应用于早期无创性呼吸道标本卡氏肺孢子虫的检测。发现mtLSU rRNA基因适合用于肺孢子虫的检测,ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因适合基因分型及系统分化研究。
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