研究背景肝硬化是由各种慢性肝脏疾病导致的肝内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）弥漫性过度沉积的病理过程。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是肝硬化发生的重要病因。如果乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）持续复制,HBV及其相关成分诱发的慢性炎症反应会促进肝硬化的持续性进展,可进一步导致门脉高压,产生食管静脉曲张（esophageal varices,EV）、脾功能亢进、腹水等严重并发症。目前临床上仍然缺乏安全有效的逆转肝硬化的治疗措施。因此,深入研究肝硬化的发生机制,及时准确地诊断肝硬化及其相关并发症,对于肝硬化防治具有重要的临床意义。肝硬化的发病机制主要包括肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）激活引起的肝内纤维结缔组织的过度沉积和肝窦内皮细胞（hepatic sinusoidal endothelialcells,HSEC）活化引起的肝内血管异常再生。其中,HSC的激活通常被认为是肝硬化发生与发展的核心过程。静息状态的HSC在各种因素作用下转分化为具有增殖、收缩、趋化、ECM分泌表型的肌成纤维样细胞。在肝脏微环境中来自周围细胞的细胞外信号通过旁分泌的方式促进HSC的活化。其中巨噬细胞在肝硬化进展及ECM重建过程中发挥着关键性调节因素。许多证据表明激活的巨噬细胞可以产生促进肝硬化发生的细胞因子,例如:生长因子、白细胞介素、趋化因子等。这些生物活性成分会激活并募集到更多的HSC,进而促进ECM的沉积。另一方面,活化的HSC也能够通过分泌趋化因子来吸引巨噬细胞,导致该病理过程的加剧。HBV进入肝细胞开始病毒复制之后便可以在肝脏和血液中检测到病毒相关蛋白。HBV相关蛋白主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg,hepatitis B surface antigen）、乙型肝炎核心相关抗原（HbcrAg,hepatitis B core-related antigen）和HBx蛋白组成。HBcrAg由前核心/核心区域编码的三种蛋白质组成,包括乙型肝炎核心抗原（HBcAg,hepatitis B core antigen）、乙型肝炎e抗原（HBeAg,hepatitis B e antigen）和22kDa前核心蛋白质。目前,关于乙肝病毒相关蛋白的生物学功能尚未完全阐明。我们课题组的前期研究表明,与HBsAg及HBcAg相比,HBeAg是激活巨噬细胞并促进细胞因子释放最重要的抗原类物质。但是,HBeAg是否可以通过巨噬细胞激活HSC并进一步促进肝硬化的发生仍然不清楚。虽然针对乙肝肝硬化发生机制的研究有助于我们解释疾病的发生过程、寻找新的治疗靶点,但是对于CHB患者而言,及时准确地诊断肝硬化及其相关并发症同样具有重要的临床意义。众所周知,肝脏活检及上消化道内窥镜检查是评估肝硬化及EV的金标准。但是这两项检查都具有有创、花费高、并伴有一定的检查风险的缺点。因此,在CHB患者漫长的疾病发展过程中反复进行上述有创检查是十分困难的,准确、有效的无创检测方法是解决上述问题的关键。二维剪切波弹性成像（two-dimensional shear wave elastography,2D-SWE）是一种无创的二维超声检测技术。2D-SWE通过声辐射力脉冲在肝脏内部产生剪切波,之后通过高频超声成像实时捕获剪切波的传导。测得的肝脏硬度（liver stiffness,LS）值与肝硬化程度密切相关。由于肝硬化程度与门脉压力在一定程度上存在正相关关系,因此该技术也被应用于EV的无创检测。多中心、前瞻性研究表明2D-SWE在诊断肝硬化及EV方面具有较为理想的准确性。但是值得注意的是:针对不同病因的肝硬化患者,2D-SWE检测到的LS是不尽相同的,所以针对不同病因的患者评估肝硬化及EV仍然需要更多的大样本含量研究来确定统一的诊断标准,才能更加准确地将其应用于临床实践。此外,2D-SWE测得的LS还会受到一些因素的影响（例如:肝内炎症活动及肝内外胆汁淤积）。因此在乙肝肝硬化患者中如何通过2D-SWE更准确地评估肝硬化及EV仍然有待于进一步研究。本研究分为三部分。在第一部分,我们在前期研究基础上发现HBeAg通过与TLR-2直接结合激活巨噬细胞并促进了 NF-κB信号通路介导的肝硬化相关细胞因子的释放。进一步证实了HBeAg的核心结构域中的C端多肽序列（122-143 aa.）是激活巨噬细胞的关键性部位。尽管HBcAg和HBeAg具有相同的核心结构域,但是富含精氨酸结构域（arginine-rich domain,ArD）隐蔽了HBcAg的免疫原性。此外,HBeAg通过巨噬细胞依赖性途径促进HSC增殖、迁移以及收缩。作用机制方面,PI3K-AKT-mTOR和p38 MAPK通路主要调控HSC的迁移,而smad依赖性TGF-β通路主要调控HSC的增殖和收缩功能。在第二部分,我们评估了在CHB患者中2D-SWE检测的LS评估肝硬化的诊断效能,并在此基础上分析了肝脏脂肪变性（hepatic steatosis,HS）对LS值及其诊断效能的影响。我们发现CHB同时伴有HS＞10%的患者更容易被高估误诊为肝硬化,因此需要调整诊断临界值或者联合其他无创指标来进一步提高其诊断效能。在第三部分,我们首先分析了在代偿期乙肝肝硬化患者中2D-SWE评估风险食管静脉曲张（highrisk varices,HRV）的最佳临界值及其诊断效能。进一步研究发现LS联合血小板计数（platelet counts,PLT）可以提高2D-SWE诊断HRV的效能并且不受乙肝抗病毒治疗史的影响。综上,本研究为乙肝肝硬化及门脉高压的发生提出了新机制;同时为2D-SWE准确无创评估乙肝肝硬化及相关并发症提供了新的临床思路及优化方案,具有重要的临床意义。第一部分 HBeAg通过TLR-2调节巨噬细胞分泌细胞因子促进肝硬化的机制研究目的我们课题组的前期研究表明,与HBsAg和HBcAg相比,HBeAg是激活巨噬细胞最重要的抗原类物质。本研究旨在进一步分析巨噬细胞识别HBeAg的受体和HBeAg的功能域,以及HBeAg通过巨噬细胞激活HSC进而促进肝硬化发生的作用及机制。方法1.根据前期研究,以2μg/mL浓度的HBeAg在不同时间点刺激巨噬细胞,采用qRT-PCR技术分析肝硬化相关细胞因子（如:IL-6与TNF-α）表达的时间梯度,确定HBeAg的最佳作用时间点;采用RNAseq检测HBeAg激活巨噬细胞的基因表达,并采用qRT-PCR进行验证,筛选出可能参与巨噬细胞识别HBeAg的关键性受体家族。2.通过受体抑制剂、RNA干扰和中和抗体阻断可能的识别受体,之后采用qRT-PCR、ELISA、和Western blot技术检测细胞因子及信号通路改变,筛选出目标受体。最后通过体内及体外Co-IP实验证实目的受体与HBeAg直接作用。3.采用qRT-PCR和ELISA技术比较HBcAg与HBeAg对巨噬细胞激活能力的差异。根据HBcAg与HBeAg序列及结构域差异,构建结构域重组蛋白刺激巨噬细胞,分析巨噬细胞激活的功能域。通过生物信息学分析HBeAg表面易接近性多肽序列,构建相应多肽序列缺失蛋白刺激巨噬细胞,分析HBeAg激活巨噬细胞的功能域中的关键性多肽片段。4.分别采用HBeAg以及HBeAg激活巨噬细胞的条件培养基刺激HSC,通过qRT-PCR和Western blot技术检测ECM成分及α-SMA的表达水平。另外,分别采用CCK-8、Transwell以及胶原晶格实验检测HSC的增殖、迁移和收缩能力。5.为确定HSC激活过程中的关键通路,采用磷酸化抗体芯片检测上述过程中信号通路分子的磷酸化修饰水平调变,并通过Western blot技术进行验证。根据KEGG通路富集分析及验证结果推测引起上述表型变化的信号通路。最后采用相应通路的特异性抑制剂对关键通路进行进一步验证。6.采用Luminex多因子液相芯片技术对HBeAg激活巨噬细胞过程中的细胞因子进行检测。7.以C57BL/6小鼠为研究对象,经尾静脉注射HBeAg,在不同时间点处死小鼠。对小鼠肝脏组织进行HE染色评价肝炎症坏死、炎症细胞浸润程度。检测血清ALT与AST含量,评估肝脏损伤情况。采用qRT-PCR技术检测肝脏整体细胞因子表达。8.以C57BL/6小鼠为研究对象,构建CCL4诱导的急性肝损伤模型,然后经尾静脉注射HBeAg。如上述方法评估肝炎症坏死、炎症细胞浸润及肝损伤情况。通过对肝脏组织进行α-SMA与F4/80荧光双染分析HBeAg在体内对HSC激活和巨噬细胞浸润的影响。通过对肝脏组织进行ki67与Desmin荧光双染分析体内HBeAg对HSC增殖和迁移的影响。9.为了确认体内巨噬细胞对HBeAg的识别功能,以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射含氯膦酸盐的脂质体或对照脂质体,采用IHC技术对巨噬细胞（F4/80+）清除效率进行检测。在此基础上构建CCL4诱导的急性肝损伤模型,再经尾静脉注射HBeAg。采用qRT-PCR技术检测肝脏整体细胞因子、ECM成分、α-SMA的表达。10.为了确认体内TLR-2对HBeAg的识别功能,以C57BL/6小鼠为研究对象,首先腹腔注射TLR-2的抑制剂或者对照溶剂,再经尾静脉注射HBeAg。采用qRT-PCR技术检测肝脏整体细胞因子的表达。11.本研究纳入61例急性乙肝以及151例慢性乙肝患者,收集患者的各类临床数据及相关检查结果。在急性乙肝患者中,分析血清HBeAg含量与HBV DNA、ALT、AST之间的相关性。在慢性乙肝患者中,定性以及定量分析血清HBeAg与肝硬化分期及炎症活动度相关指标之间的相关性。结果1.HBeAg刺激巨噬细胞的最佳时间为4h;RNAseq结果提示除了细胞因子、趋化因子、生长因子发生显著改变之外,TLR受体家族的表达也发生显著改变,以TLR-2和TLR-3的改变最为显著。2.通过功能学试验筛查,我们发现相比于其他TLRs,阻断TLR-2显著影响HBeAg对巨噬细胞的激活;体内及体外Co-IP实验提示HBeAg与TLR-2直接结合。3.相比于HBcAg,HBeAg对人巨噬细胞同样具有更强的激活能力;氨基酸序列与结构域分析显示N端的前肽序列与C端的ArD决定了两者的结构差异。因此,我们合成了 ArD与截短前肽的核心结构域的重组蛋白,功能学实验表明核心结构域是HBeAg激活巨噬细胞的功能域。生物信息学分析提示,HBeAg的表面易接近性多肽序列主要分布于（aa.1-17、29-96、122-143）。相比较于其他两个多肽序列,截短aa.122-143会显著影响HBeAg激活巨噬细胞的活性。4.HBeAg通过巨噬细胞依赖性方式促进了星状细胞增殖、迁移、收缩功能。5.PI3K-AKT-mTOR与p38 MAPK通路主要参与调控HSC的迁移功能,SMAD依赖性TGF-β通路主要参与调控HSC的增殖与收缩功能。6.Luminex 多因子液相芯片结果提示 CCL-2、CCL-5、CXCL-10、TNF-α、PDGF-BB等多种细胞因子参与了上述HSC的激活过程。7.HBeAg尾静脉注射进入小鼠体内4、8、12、24h并不会造成显著的肝脏损伤,在4-12h可以观察到少量炎症细胞浸润。与之相对应,肝内细胞因子的表达与血清ALT、AST呈现一过性提高。8.在联合CCL4诱导的急性肝损伤模型中,HBeAg可以进一步加重肝脏损伤,促进巨噬细胞浸润,以及星状细胞的激活、增殖与迁移。9.腹腔注射氯膦酸盐的脂质体的第1天和第4天,巨噬细胞几乎被完全清除。在上述两种动物模型中,清除巨噬细胞可以显著降低肝脏整体的生长因子、炎症因子、趋化因子的表达。星状细胞活化及ECM分泌功能同样受到抑制。10.体内阻断TLR-2之后,肝脏整体的促炎细胞因子及趋化因子表达降低,抑炎细胞因子表达提高。11.在急性乙肝患者中,HBeAg含量与HBV DNA水平呈正相关（r=0.476,p＜0.05）。血清HBeAg含量高于100 COI的患者血清ALT与AST含量高于其他患者（P＜0.05）。在慢性乙肝患者中,HBeAg-与HBeAg+患者的炎症活动度并无显著差异（p=0.103）,亚组分析仅G=0及G≥1比较存在差异（p=0.030）,即HBeAg+的患者具有任意程度炎症活动度的比例高于HBeAg-的患者。在HBeAg+的患者中,巨噬细胞浸润（CD68+）与HBeAg含量呈正相关（r=0.557,p=0.003）。HBeAg+患者的肝硬化程度高于HB eAg-患者（p=0.004）,肝硬化相关并发症的发生率亦高于HBeAg-患者。此外,在HBeAg+的患者中,活化的星状细胞（α-SMA+）数目与HBeAg含量呈正相关（r=0.515,p=0.014）。结论HBeAg通过TLR-2/NF-κB信号通路激活巨噬细胞,并通过旁分泌的方式激活HSC,促进其迁移、增殖和收缩,进而促进肝硬化的发生。第二部分 肝脏脂肪变性影响二维剪切波弹性成像诊断乙肝肝硬化效能的研究目的2D-SWE在无创评估肝硬化方面发挥着重要的作用,我们旨在确定在CHB患者中,HS是否会影响2D-SWE诊断的准确性。方法1.本研究纳入161名CHB患者,收集患者临床标本、入院检查数据及2D-SWE检测的LS值。2.根据METAVIR合作研究小组的诊断标准评估肝硬化程度和炎性活动度。HS的严重程度定义为使用油红染色法测得的含有脂滴肝细胞的百分比。结果1.在肝纤维化早期（F0-F2或F0-3）患者中,LS数值与HS严重程度独立相关。2.在纤维化分期 F0-2（6.82±1.57 vs.7.92±1.99,p=0.010）或 F0-3（7.18±1.84 vs.8.25±1.91,p=0.007）患者中,伴有显著脂肪变性患者（S≥10%）的LS值高于不伴有显著脂肪变性的患者。3.在伴有显著脂肪变性患者中,诊断进展期纤维化（16.00%vs.37.04%,p=0.037）和肝硬化（6.67%vs.21.62%,p=0.030）的假阳性率更高。结论在CHB伴有显著脂肪变性（＞10%）的患者中,2D-SWE测得的LS会高估肝硬化的严重程度。针对此类患者可以考虑将LS与其他无创检测指标相联合以提高2D-SWE的诊断效能。第三部分 二维剪切波弹性成像联合血小板计数预测乙肝肝硬化患者高风险食管静脉曲张的研究目的EV是乙肝肝硬化的重要并发症,早期诊断HRV张采取初级预防措施有助于降低患者上消化道出血风险并延长患者生存期。本研究旨在前瞻性地分析2D-SWE测得的LS联合PLT预测HRV的临界值,并通过亚组分析抗病毒治疗史是否会影响其联合预测效能。方法1.本研究纳入160名代偿期乙肝肝硬化患者,收集患者的血清学指标、2D-SWE测得的LS以及上消化道内窥镜检测结果。2.在整体研究队列中分析2D-SWE测得的LS联合PLT预测HRV的临界值及诊断效能。3.根据入院之前的6个月是否进行连续性抗病毒治疗,亚组分析抗病毒治疗史对2D-SWE测得的LS联合PLT预测HRV诊断效能的影响。结果1.在整体研究队列中,预测HRV的最佳LS临界值为14.5 kPa。2.根据扩大化Baveno Ⅵ指南建议,PLT的预测临界值采用110×109/L以便进一步降低上消化道内窥镜有创检测使用率。经分析,符合LS值＜14.5 kPa和PLT＞110×109/L的患者可以排除HRV的风险,其阴性预测值为0.99,并且可以使67.50%（108/160）的患者避免接受上消化道内窥镜检查。3.此外,符合LS值≥14.5 kPa和PLT≥110×109/L的患者可以被预测为HRV,其阳性预测值为0.82,并且可以使10.63%（17/160）的患者避免接受上消化道内窥镜检查。4.亚组分析结果表明抗病毒治疗史并不会显著影响2D-SWE测得的LS联合PLT预测HRV的诊断效能及内窥镜节省比率。结论在代偿期乙肝肝硬化患者中,通过2D-SWE测量的LS（14.5 kPa）联合PLT（110×109/L）可以准确预测HRV,且预测效能不会受到患者抗病毒治疗史的干扰。