Wnt-10a在红系分化中的功能研究

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红系分化是生物体内复杂又精细的重要调控过程之一,涉及机体的发育,干细胞分化与体细胞起源,细胞癌变的调控失序等。红系分化的过程由众多的转录因子,小分子物质如piRNA和microRNA,各种信号通路的综合调控协同进行。当其中的某种调控方式出现异常,则可能会使得造血干细胞的正常分化机制失调,细胞过度增殖导致疾病甚至癌症的发生。一系列关于白血病的相关研究中已发现,在某些小分子物质如亚铁血红素、二甲基亚砜、丁酸钠等的诱导下白血病细胞能够发生逆转,表明细胞的分化状态可以被人为地调控。至今为止,主要是通过发现和研究与分化相关的蛋白质(如细胞分化因子)的功能来解析红系分化调控机制。蛋白质组学的思路与技术以及基因芯片等技术为此研究提供了关键的支撑作用,也为研发能使白血病细胞自癌变状态脱离,进入可控正常分化凋亡途径并且适用于临床的的诱导剂提供了实验依据。  各种白血病细胞如MEL细胞与K562是研究细胞分化的重要模型细胞系,在某些诱导剂存在的体外培养条件下,这些细胞能够进入红系分化途径,重新表达分化后特有的红系标志蛋白如血红蛋白和血型糖蛋白A等。本文前期利用双向凝胶电泳/质谱蛋白质组学技术,通过比较亚铁血红素(Hemin)诱导人白血病细胞K562分化前后的差异蛋白质组,得到了数百种差异表达的蛋白质。  Wnt是一大类与胚胎发育,干细胞维持与分化,细胞增殖、迁移、极性决定、死亡及癌症发生有关的分泌型糖蛋白家族。由于Wnt信号转导途径也参与了干细胞的分化调控,而Wnt-10a又是在K562细胞诱导前后呈现明显差异表达的蛋白质。为了进一步研究Wnt-10a在红系分化中的功能及其与红系分化的关系,本文通过Western Blot,半定量PCR,Real-Time PCR对Wnt-10a在K562细胞诱导分化过程中表达量的变化进行分析,又通过免疫细胞化学研究了Wnt-10a蛋白在细胞中的定位情况,同时利用MTT实验对诱导分化的K562细胞活性变化进行了检测。此外,通过构建Wnt-10a重组过表达载体来提高K562细胞中Wnt-10a的表达量后进行细胞诱导分化能力和Wnt信号途径中关键因子蛋白水平的检测,加入Wnt信号传导途径的激活剂来进一步研究Wnt信号途径对红白血病细胞诱导分化所产生的影响。  结果表明:在Hemin诱导K562细胞分化过程中,Western Blot和半定量PCR分析均发现细胞中的Wnt-10a蛋白表达量和mRNA量都出现了短暂下降后回复的趋势,于此同时,也在K562诱导分化的过程中Wnt-10a向胞膜迁移。而Western Blot、半定量PCR与Real-Time PCR都证实了在Hemin诱导K562细胞红系分化的过程中,Wnt蛋白所参与的三条信号途径中的关键因子表达水平均有着不同程度的变化,说明Wnt信号通路在红系分化中起着重要的作用。使用Wnt信号通路抑制剂后,诱导分化过程中的细胞增殖活力提高情况,Wnt-10a过表达后,K562被Hemin诱导分化的能力也有了提高,并且Wnt经典信号途径的关键因子表达水平也有上升,上述两点同样从另一个侧面证实Wnt信号通路对于白血病的发生有着显著影响。  上述的研究结果表明Wnt-10a乃至Wnt信号通路对哺乳动物细胞红系分化的作用具有值得继续深入探讨的价值。也为进一步揭示细胞红系分化机制的研究打下了基础。
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