【摘 要】
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念珠菌属是一类侵袭性真菌感染常见的病原体,在人畜生活的环境中广泛存在。白色念珠菌一直被认为是侵入性真菌感染的主要病原菌,但近年来热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等其他非白色念珠菌的感染率越来越高,克柔念珠菌因具有强大的细胞表面疏水性和对氟康唑天然耐药等特点,其感染率持续上升。研究表明,克柔念珠菌对抗真菌药物产生抗性的机制主要包括药物靶标基因的过表达和/或突变、药物外排泵基因的过表达
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（32060816）；
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念珠菌属是一类侵袭性真菌感染常见的病原体,在人畜生活的环境中广泛存在。白色念珠菌一直被认为是侵入性真菌感染的主要病原菌,但近年来热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等其他非白色念珠菌的感染率越来越高,克柔念珠菌因具有强大的细胞表面疏水性和对氟康唑天然耐药等特点,其感染率持续上升。研究表明,克柔念珠菌对抗真菌药物产生抗性的机制主要包括药物靶标基因的过表达和/或突变、药物外排泵基因的过表达、生物被膜的形成等。目前,针对于降低和逆转克柔念珠菌耐药性的研究主要集中在抗真菌药物的联合应用方面,探索天然产物联合抗菌的研究,将为临床安全有效控制念珠菌耐药性问题提供实验数据。本研究采用亚抑菌浓度的伊曲康唑（ITR）人工体外诱导获得耐ITR的克柔念珠菌,利用比浊法、XTT比色法、Sport assay、RT-qPCR和基因测序等实验,分析耐药株与标准株在耐药相关特性方面的差异;药敏实验检测月桂酸单甘油酯（GML）、汉防己甲素（TET）单独及与ITR联用对菌株耐药性的影响;XTT 比色法结合RT-qPCR实验探究GML、TET单独及与ITR联用对菌株耐药性的分子机制。实验发现,以0.0625 μg/mL为初始浓度的ITR诱导获得MIC为2 μg/mL的耐药株ATCC 6258-R;该耐药菌株外排泵基因ABC1、ABC2的表达量与标准株相比极显著上调（P＜0.01）;ABC1基因出现同义突变（A523C）。GML对耐药株与标准株的MIC均为15.625μg/mL,TET对耐药株与标准株的MIC均为100 μg/mL;GML联合ITR作用于耐药株FIC指数为0.56,表现为相加的作用效果;GML联合TET作用于耐药株的FIC指数为0.52,表现为相加的作用效果;TET联合ITR作用于耐药株的FIC指数为0.28,表现为协同的作用效果。GML、TET单用可在短时间内降低耐药株对ITR的耐药性,但随着作用时间的延长,菌株的耐药性又恢复;TET与ITR联用和GML与TET联用均可以降低耐药株的耐药性,其中TET与ITR同时作用和GML与TET同时作用可以逆转菌株的耐药性,将ITR对耐药株的MIC由2 μg/mL降至0.5 μg/mL。GML单用可以抑制耐药株生物被膜的形成,显著下调耐药相关基因ERG11、ABC1、ABC2的表达（P＜0.05）;TET单用可以抑制耐药株生物被膜的形成、早期生物被膜的黏附,破坏成熟生物被膜的稳定,显著下调ERG11、ABC1、ABC2基因的表达（P＜0.05）;GML与ITR同时作用可以显著抑制耐药株生物被膜的形成、早期生物被膜的黏附,显著破坏成熟生物被膜的稳定,显著下调ABC1、ABC2基因的表达（P＜0.05）,但假菌丝生长未被抑制,ERG11基因表达显著上调（P＜0.05）;GML与TET同时作用可以显著抑制耐药株生物被膜的形成、早期生物被膜的黏附、假菌丝的生长,显著破坏成熟生物被膜的稳定,显著下调ERG11、ABC2基因的表达（P＜0.05）,但ABC1基因表达显著上调（P＜0.05）;TET与ITR同时作用可以显著抑制耐药株生物被膜的形成、早期生物被膜的黏附、假菌丝的生长,显著破坏成熟生物被膜的稳定,显著下调ERG11、ABC1、ABC2基因的表达（P＜0.05）。结果表明,人工诱导耐ITR的克柔念珠菌菌株耐药性的产生与外排泵基因ABC1、ABC2的过表达有关。GML与TET联用和TET与ITR联用均可以降低克柔念珠菌对ITR的耐药性。GML与TET同时作用和TET与ITR同时作用可以通过抑制耐药株生物被膜的形成、早期生物被膜的黏附、假菌丝的生长,破坏成熟生物被膜的稳定,下调靶标基因和外排泵基因的表达,逆转克柔念珠菌对ITR的耐药性。
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