H5亚型禽流感病毒(AIV)可引起家禽急性发病和大量死亡,造成严重的经济损失。该病毒在自然选择条件下和疫苗选择压下很容易发生变异,形成适应性的优势流行株。自1996年第一株亚洲H5N1亚型高致病性AIV在广东省某发病鹅群被分离到以来,H5N1亚型AIV的NA基因出现了不同形式的缺失,且茎部第49-68位缺失20个氨基酸的缺失株占绝对优势,成为近年来流行的优势流行株。前期研究初步发现,NA茎部缺失有助于H5亚型AIV拮抗干扰素,但相关机制仍不清楚。本研究以NA茎部缺失的H5亚型AIV为母本,按照已有的禽流感病毒NA基因茎部缺失模式或在NA茎部添加不同长度氨基酸,构建一系列只有NA茎部突变,其他基因与母本病毒骨架一致的全禽源NA突变的重组病毒,测定其生物学特性及拮抗干扰素能力的差异,分析NA茎部缺失在H5N1亚型AIV拮抗干扰素过程中的作用,对发挥拮抗干扰素的功能位置进行定位,该研究对解析H5N1亚型AIV的进化机制具有重要的学术意义。1 H5N1亚型AIV NA基因茎部缺失株的构建及生物学特性的测定以一株NA茎部49-68位缺失20个氨基酸和NS1 80-84位缺失5个氨基酸的H5N1亚型AIV(A/mallard/Huadong/S/2005)为母本病毒,构建了 5株突变病毒,分别为NA基因茎部不缺失(rSNA+),缺失5个氨基酸(rSNA-5),缺失10个氨基酸(rSNA-10),缺失15个氨基酸(rSNA-15)和缺失20个氨基酸(rSNA-20),并测定了其生物学特性。结果显示,5株突变病毒的TCID50、EID50和MDT值无显著性差异。其生长曲线表明,NA茎部加长可增强H5N1亚型AIV在MDCK和CEF细胞上的复制能力,而NA茎部缺失会小幅度地提高H5N1亚型AIV在Vero细胞上的复制能力。神经氨酸酶试验表明NA茎部越长NA活性越高。空斑试验显示随着NA茎部的加长空斑直径增大。5株突变病毒以MOI=0.001分别感染CEF和MDCK细胞6h、12h和24h,应用相对荧光定量PCR方法(以GAPDH为内参)检测细胞IFN-α和IFN-β的转录表达水平,结果显示,即在12h内,两种细胞IFN-α和IFN-β mRNA的表达量随着NA茎部的缩短而升高,在24 h随着NA茎部的缩短而降低,表明病毒NA茎部的变化也可以影响细胞干扰素转录水平的表达。因此,NA茎部缺失可以影响病毒的体外复制能力和神经氨酸酶活性以及干扰素转录水平。2 NA基因茎部缺失对病毒拮抗干扰素能力的影响首先,用表达不同NA茎部长度的pcDNA3.1(+)真核质粒转染Vero细胞24h后,加入不同浓度的IFN-β作用24 h,再用突变病毒感染IFN-β预处理过的Vero细胞,测定TCIDs0。结果表明,5个茎部不同长度的NA真核表达质粒对突变病毒拮抗干扰素的能力都有所提高,且真核质粒pcDNA3.1(+)-NA-15和pcDNA3.1(+)-NA-20对突变病毒拮抗干扰素的作用更明显。再将5株突变病毒以MOI=0.001感染不同浓度IFN-β预处理过的Vero细胞,感染后72 h收集细胞上清,测定TCID50,结果显示rSNA+、rSNA-5和rSNA-10在IFN-β浓度达到1600U时,TCID5o滴度变为0;rSNA-15和rSNA-20在IFN-β浓度达到10000U时,仍可以复制。该结果表明,NA分别缺失15个氨基酸和20个氨基酸均提高了H5N1亚型AIV拮抗干扰素的能力。3 NA基因茎部缺失对NS1表达的影响首先,为了获得检测NA和NSI蛋白的抗体,本研究通过扩增NA-20和NS1基因,连接原核表达载体PET-32a(+)进行原核表达,纯化蛋白后免疫小鼠,获得NA-20和NSI的多抗血清。结果显示,NA-20和NS1多抗血清的反应性良好,不仅可以分别检测NA和NS1自身蛋白,而且NA-20多抗血清还可以检测茎部加长蛋白NA+、NA-5、NA-10和NA-15。其次,5株突变病毒以MOI = 0.001感染CEF细胞,利用Western-blot测定在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h时的NA和NS1蛋白表达水平。试验结果显示,在不同时间点,随着NA茎部的缺失,NA蛋白的表达量逐渐减少而NS1蛋白的表达量逐渐增多。最后,各突变病毒感染以400 U IFN-β预处理的Vero细胞后,应用相对荧光定量PCR方法(以M基因作为内参)检测NA和NS1基因mRNA的转录水平。结果显示,NA茎部缺失20个氨基酸的毒株(rSNA-20),在不同时间点(6h、12h和24h)NS1mRNA的表达量均比其他各缺失株高,且大致呈现出随着NA茎部的缩短NS 1 mRNA的表达量逐渐增加的趋势,但是,NA的mRNA的表达量无显著性差异。综上所述,H5N1亚型AIV NA茎部缺失株拮抗干扰素的作用位点在茎部缺失15或20个氨基酸,可能是通过增强NSI的表达来拮抗干扰素的。