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目的:食源性致病菌污染是影响我国食品安全,引起食源性疾病、危害人民大众健康的最主要因素之一。因此,加强对食品致病菌的污染检测就显得尤为重要。本研究是以大肠杆菌O157∶H7为食源性致病菌的代表靶标物,运用化学发光磁免疫分析技术进行检测,最终建立的食源性致病菌检测方法具有高灵敏性,特异性、易操作等优点,为快速检测食源性致病菌提供了思路和技术支持。 方法:1、采用经典甲醛灭活法制备大肠杆菌O157∶H7灭活全菌抗原以消除致病性,作为抗体制备的免疫原;2、采用常规免疫法免疫雌性家兔制备大肠杆菌O157∶H7抗血清,待抗血清达到一定效价后对家兔进行颈总动脉采血,应用辛酸-硫酸铵法、Protein A亲和层析法进行多克隆抗体的初级纯化和二级纯化;3、利用抗大肠杆菌O157多抗磁珠作为捕获平台,建立以免疫磁颗粒为基础的样品前处理技术,进而实现对检测物的分离和快速富集。4、建立双抗夹心化学发光酶免疫分析法检测大肠杆菌O157∶H7,并优化检测方法及条件,验证特异性,并对脱脂牛奶及牛肉汤进行加标回收检测,运用Wilcoxon配对符号秩和检验,验证牛肉汤和脱脂牛奶中检测浓度和添加浓度有无差别。 结果:1、常规免疫后,家兔体内成功分离出抗大肠杆菌O157∶H7的血清,抗血清效价可达1∶32000,抗血清特异性良好,仅对大肠杆菌O138和大肠杆菌O139有轻微非特异性反应;2、通过辛酸-硫酸铵法、Protein A亲和层析法纯化抗血清,得到高纯度兔源性抗大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体,多抗效价可达1∶12500;3、通过优化反应条件,最终选择37℃作为反应温度,免疫磁珠用量20μL,捕获抗体与抗原反应40min,检测抗体与抗原反应20min,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗稀释至1∶10000与检测抗体反应20min后进行化学发光检测,上机检测5min后发光值趋于稳定,标准曲线拟合优度0.968,最低检出限102~103CFU/mL,特异性良好,检测时限为2~3h,回收率在80.38%~118.51%之间。Wilcoxon配对符号秩和检验结果分析,检测牛肉汤P=0.627,P>0.05,按α=0.05水准,不能认为该方法在牛肉汤的检测浓度和添加浓度有差别;检测脱脂牛奶P=0.597,P>0.05,按α=0.05水准,不能认为该方法在脱脂牛奶的检测浓度和添加浓度有差别。 结论:1、常规免疫法获得了亲和力较强、特异性较高的兔源抗大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体,建立了针对大肠杆菌O157∶H7致病菌检测抗体的制备方法;2、应用免疫磁颗粒为基础的样品前处理技术,能够快速富集食源性致病菌;3、建立了化学发光磁酶免疫分析技术,能够快速检测大肠杆菌O157∶H7,并对实际样品进行加标回收,回收值较好。