【摘 要】
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目的:本实验研究青天葵甲醇提取物(Nervilia Fordii methanol extracts,NFME)体外对鼻咽癌细胞株CNE-2和C666-1的抑制作用,探索NFME中鼠李柠檬素诱导鼻咽癌细胞株的凋亡作用,并研究鼠李柠檬素诱导鼻咽癌细胞CNE-2和C666-1凋亡的分子机制。方法:超声提取法提取出青天葵的甲醇提取物,三氯化铝比色法检测青天葵甲醇提取物中总黄酮的含量。MTT法检测NFME
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目的:本实验研究青天葵甲醇提取物(Nervilia Fordii methanol extracts,NFME)体外对鼻咽癌细胞株CNE-2和C666-1的抑制作用,探索NFME中鼠李柠檬素诱导鼻咽癌细胞株的凋亡作用,并研究鼠李柠檬素诱导鼻咽癌细胞CNE-2和C666-1凋亡的分子机制。方法:超声提取法提取出青天葵的甲醇提取物,三氯化铝比色法检测青天葵甲醇提取物中总黄酮的含量。MTT法检测NFME和鼠李柠檬素对CNE-2和C666-1细胞活性的影响;克隆原形成实验验证NFME和鼠李柠檬素对CNE-2和C666-1细胞集落形成能力的影响;Hoechst凋亡染色实验观察NFME和鼠李柠檬素对CNE-2和C666-1细胞的凋亡作用;流式细胞术验证青天葵中鼠李柠檬素具有诱导CNE-2和C666-1细胞凋亡的作用;蛋白免疫印迹(Western blot)检测鼻咽癌细胞中凋亡相关蛋白(Caspase3,Caspase8,Caspase9,PARP,Survivin,Bax,Bcl-2,Mcl-1)表达水平的变化;Western Blot检测不同浓度和时间鼠李柠檬素对鼻咽癌细胞内Akt、ERK和IGF-1R蛋白表达的影响;MTT检测Akt通路抑制剂LY294002和ERK通路抑制剂U0126联用对CNE-2和C666-1细胞活性的影响。结果:(1)青天葵甲醇提取物中总黄酮含量4.72±0.13mg/g。(2)MTT结果显示,与空白对照组相比,NFME在250μg/ml对CNE-2和C666-1细胞有抑制作用(P<0.05);鼠李柠檬素在10,20,40,80μM对C666-1细胞有抑制作用(P<0.05),在40,80μM时对CNE-2细胞有抑制作用(P<0.01)。(3)克隆原形成实验结果显示,与空白对照组相比,NFME在0.2,0.4,0.8mg/ml抑制CNE-2细胞集落形成(P<0.05),在0.4,0.8 mg/ml抑制C666-1细胞集落的形成(P<0.01);与空白对照组相比,鼠李柠檬素在20,40,80μM抑制CNE-2和C666-1细胞集落的形成(P<0.01)。(4)Hoechst凋亡染色结果显示,与空白对照组相比,NFME在0.2和0.4mg/ml时CNE-2和C666-1细胞出现较强蓝色荧光,细胞都出现凋亡(P<0.01);鼠李柠檬素在40和80μM时CNE-2细胞出现凋亡(P<0.01),在80μM时C666-1细胞出现凋亡(P<0.01)。(5)流式细胞术结果发现,与空白对照组相比,鼠李柠檬素能够诱导CNE-2和C666-1细胞的凋亡(P<0.05)(6)Western Blot结果显示,鼠李柠檬素诱导CNE-2和C666-1细胞中Caspase3,Caspase8,Caspase9的活化,从而诱导鼻咽癌细胞的凋亡;抑制抗凋亡相关蛋白Survivin,Bcl-2,Mcl-1的表达;激活诱导凋亡相关蛋白Bax的表达。检测发现鼠李柠檬素抑制细胞膜上蛋白IGF-1R的磷酸化,同时检测IGF-1R下游Akt和ERK信号通路,发现鼠李柠檬素能明显抑制Akt和ERK1/2的磷酸化,且抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性。(7)最后MTT结果验证得出,Akt通路抑制剂LY294002和ERK通路抑制剂U0126联用对鼻咽癌细胞的抑制作用与鼠李柠檬素对鼻咽癌细胞的抑制作用相似。结论:青天葵体外具有抗鼻咽癌细胞株的作用,其中黄酮类化合物鼠李柠檬素能够诱导鼻咽癌细胞CNE-2和C666-1的凋亡,其作用机制可能是通过IGF-1R通路从而同时抑制Akt和ERK信号通路,进而诱导细胞凋亡。
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