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目的:筛选和验证氟作用下大鼠骨肉瘤细胞差异表达的miR-23a,利用miR-23a表达载体和miR-23a反义寡核苷酸探讨miR-23a对染氟UMR-106细胞成骨活性的影响。方法:1、染氟UMR-106细胞差异性miRNA的筛选及验证:通过miRNA芯片筛选染氟UMR-106细胞差异表达的mi R-23a作为研究对象,通过Real-time PCR法验证mi R-23a表达水平,并通过生物信息学分析,预测miR-23a的靶基因及其参与的生物学功能及信号通路。2、mi R-23a对染氟UMR-106细胞成骨活性的影响:(1)NaF对UMR-106细胞成骨活性影响:以0、5×10~2、10~3和2×10~3μmol/L NaF作用UMR-106细胞24h、48h和72h,Real-time PCR检测ALP、BGP、BMP-2、CoL I、Runx2、Osx mRNA的表达,Western Blot测定CoL I、Runx2及Osx蛋白表达,磷酸苯二钠法检测ALP活性。(2)mi R-23a在染氟UMR-106细胞成骨活性变化中的作用:过表达或抑制miR-23a对染氟UMR-106细胞成骨活性的影响:利用Real-time PCR法检测ALP、BGP、BMP-2、CoL I、Runx2、Osx mRNA的表达,Western Blot法测定CoL I、Runx2、Osx蛋白水平。3、mi R-23a靶基因验证:用Real-time PCR和Western Blot检测miR-23a潜在靶基因的表达水平,双荧光素酶报告基团验证miR-23a与靶基因的靶标关系。结果:1、染氟UMR-106细胞差异性miRNA的筛选及验证:miRNA芯片共筛选出10个差异表达的miRNA,Real-time PCR法测定miR-23a结果同miRNA芯片结果一致,mi R-23a靶基因涉及成骨分化和骨代谢相关MAPK、FoxO通路。2、miR-23a对染氟UMR-106细胞成骨活性的影响:(1)NaF对UMR-106细胞成骨活性影响:(1)NaF作用24h,低氟组BMP-2 mRNA表达升高,染氟组BGP表达升高,中、高氟组ALP、Runx2及Osx mRNA表达较对照组降低。(2)NaF作用48h,中、高氟组ALP、Col I、BMP-2、Runx2 mRNA表达较对照组下降,高氟组Osx mRNA表达较对照组降低。(3)NaF作用72h,低氟组ALP、BGP、Runx2、Osx mRNA表达水平较对照组升高;中、高氟组ALP、Col I、BMP-2、Runx2、Osx mRNA表达较对照组降低。(4)NaF作用24h,各剂量组细胞ALP活性较对照组升高,NaF作用48h、72h,中氟组细胞及培养液ALP活性较对照组高。(5)NaF作用24h,高氟组Runx2、Col I蛋白表达水平较对照组低。NaF作用48h,Col I蛋白表达随着染氟浓度的升高而降低;高氟组Runx2蛋白表达降低。NaF作用72h,与对照组比较,高氟组Col I、Runx2、Osx蛋白表达降低。(2)miR-23a在染氟UMR-106细胞成骨活性变化中的作用:(1)pcDNA3.1/mi R-23a组ALP、Col I、BMP-2 mRNA表达水平较pcDNA3.1组降低,Runx2、BGP mRNA较pcDNA3.1组升高,pcDNA3.1/miR-23a/NaF组ColI mRNA的表达较NaF组降低。pcDNA3.1/mi R-23a组Col I和Runx2蛋白表达较pcDNA3.1组降低。(2)anti-miR-23a组ALP mRNA、Col I蛋白表达较anti-NC组上升。anti-miR-23a/NaF组BGP、Runx2 mRNA较NaF组上升。3、miR-23a靶基因验证:(1)anti-miR-23a组Rap1b mRNA较anti-NC组表达降低。(2)miR-23a mimics+Rap1b WT组荧光素酶活性较mimics NC+Rap1bWT组比较差异无统计学意义。结论:1、NaF作用下UMR-106细胞mi R-23a表达上调,mi R-23a靶基因富集于成骨分化及骨代谢信号通路,miR-23a可能参与NaF作用下的成骨细胞调控。2、氟对成骨细胞活性的影响具有双向调控作用,氟对成骨活性的影响可能与氟作用剂量及细胞因子间联合作用相关。3、miR-23a过表达时,染氟UMR-106细胞Col I mRNA的表达降低,抑制miR-23a时,染氟UMR-106细胞BGP、Runx2 mRNA表达升高,提示miR-23a可能在氟作用下的成骨活性表达过程中有着一定的作用。4、双荧光素酶报告基团提示miR-23a与Rap1b的3’UTR无直接的靶向关系。