目的:百草枯(Paraquat,PQ)是一种快速灭生性除草剂,因毒性大且无特效解毒药,目前已被多个国家严格限制使用。毒理学研究发现PQ诱导神经炎症和氧化应激反应,并对线粒体氧化呼吸链复合体产生非选择性抑制。慢性PQ暴露可造成大脑黑质致密部多巴胺能神经元大量丢失,产生与帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)相似的病理改变。星形胶质细胞主要通过分泌大量信号分子参与中枢神经系统发育和大脑内环境稳态的调节。在损伤和应激条件下,星形胶质细胞发生反应性激活,以细胞形态变化和中间丝蛋白上调为主要特征,伴随多种具有重要生理功能的基因表达改变,对神经细胞产生损伤和保护双向调节作用。既往在体实验发现PQ暴露可引起星形胶质细胞反应性激活。然而,PQ对星形胶质细胞分泌途径的影响尚无明确报道。分泌粒蛋白(Secretogranins)分布在神经系统和神经内分泌系统的大致密核心囊泡(large dense core vesicle,LDCV)内,常被作为标记蛋白应用于LDCV分泌机制的研究。分泌粒蛋白通过特定区域与功能分子结合,将核心聚集物连接至富含胆固醇的分泌囊泡界膜上,在活性蛋白的组装、靶向运输以及后续通过调节性分泌途径释放的过程中发挥重要作用。研究发现,分泌粒蛋白参与神经系统和神经内分泌系统的肽类激素的合成与靶向运输,在多种神经及精神疾病中出现表达异常和分泌改变,暗示分泌粒蛋白介导的神经递质调节性分泌障碍可能参与疾病的发生和进展。进一步研究发现,在星形胶质细胞中分泌粒蛋白II(secretogranin II,SCG2/Sg II)参与神经调质的Ca2+依赖性调节分泌;穿孔性脑损伤和阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)动物模型中反应性激活的星形胶质细胞中分泌粒蛋白III(secretogranin III,SCG3/Sg III)表达水平显著增高,推测SCG3囊泡急剧增加为各种肽类物质及时存储与运输做好准备。研究同时发现过表达SCG3的星形胶质细胞聚集在AD的淀粉样斑块和失能神经元周围,提示SCG3可能在异常蛋白的吸收和神经损伤修复过程中发挥重要作用。基于以上研究,本实验选取PQ为诱导因素,研究PQ暴露下星形胶质细胞特征性因子的改变。并在星形胶质细胞反应性激活的模型下,探究SCG2和SCG3的表达变化及其在炎性因子、神经营养因子和神经递质靶向表达和分泌中的作用,为PQ的毒理机制和PD发病机制的深入研究提供新的思路。研究方法:1、本研究选取具有星形胶质细胞基本特征的U118细胞为研究对象,体外探究PQ暴露下星形胶质细胞的反应变化。应用MTS法检测U118细胞经PQ诱导后细胞生存活力变化,倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变。2、通过蛋白免疫印迹检测PQ诱导下U118细胞内pro-Casp-3及PARP(poly ADP-ribose polymerase)的表达变化。3、流式细胞Annexin V/PI双重染色证实细胞的凋亡情况。4、通过细胞免疫荧光检测U118细胞内星形胶质细胞反应性激活标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和S100β的表达变化,并分析PQ诱导前后U118细胞平均细胞面积和形态变化,体外构建PQ诱导的星形胶质细胞反应性激活模型。5、通过流式细胞术评价该模型下U118细胞的周期变化,荧光实时定量PCR技术分析U118细胞内星形胶质细胞特征性因子m RNA表达变化。6、通过荧光实时定量PCR检测PQ诱导反应性激活的U118内SCG2和SCG3 m RNA表达变化。7、通过蛋白免疫印迹分析PQ诱导前后细胞内及分泌出胞的SCG2和SCG3蛋白表达变化。8、通过细胞免疫荧光检测SCG2和SCG3阳性囊泡的亚细胞分布改变。9、应用si RNA对SCG2和SCG3的表达进行干扰,荧光实时定量PCR检测两者沉默后U118细胞内星形胶质细胞特征性因子的表达变化。10、蛋白免疫印迹分析SCG2沉默后U118细胞中炎性因子IL-6和星形胶质细胞功能性蛋白谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)蛋白表达变化。11、应用细胞免疫荧光检测反应性激活前后U118细胞中SCG2阳性囊泡与IL-6和GS的共定位水平。12、应用细胞免疫荧光检测反应性激活前后U118细胞中SCG3阳性囊泡与IL-6和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)蛋白的共定位水平,并分别分析PQ诱导前后两者亚细胞分布的变化。结果:1、PQ诱导的U118细胞,细胞生存活力随PQ剂量和处理时间下降。半抑制浓度(IC50)下可见细胞数目增多,细胞肿胀和突起增多及扭曲。诱导晚期,细胞数目降低,胞体皱缩,突触变短甚至消失。2、IC50条件下,细胞内未见明显的Casp-3系统激活。仅在诱导72 h后pro-Casp-3含量明显降低,并出现PARP切割。表明PQ诱导U118细胞出现迟发性凋亡。3、流式细胞术结果显示PQ诱导72h后Annexin V(+)/PI(+)的U118细胞比例开始明显上升。证实PQ诱导U118细胞出现迟发性凋亡,并说明此时细胞凋亡主要以晚期凋亡为主。4、PQ诱导48 h后,U118细胞逐渐从双极型向多极型转化,细胞体平均面积增大,星形胶质细胞反应性激活标志蛋白GFAP和S100β的表达升高,证明星形胶质细胞出现反应性激活表现。5、PQ诱导48 h后,S期细胞比率增加;诱导晚期,S期细胞比率增加明显并伴有G2/M期细胞减少。提示PQ诱导U118细胞发生S期周期阻滞。6、PQ诱导反应性激活的U118细胞内星形胶质细胞功能蛋白GFAP、S100β和GS,炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、IL-1β和IL-6及营养因子BDNF和胶质源性神经营养因子(glia-derived neurotrophic factor,GDNF)的m RNA表达水平上升。诱导晚期,功能蛋白和营养因子表达下降,而炎性因子继续上升。7、PQ诱导反应性激活的U118细胞内,SCG2 m RNA和蛋白表达水平较对照组相比呈现先上升后下降趋势,48 h表达水平最高;而SCG3表达水平与对照组相比总体呈现逐渐上升趋势。8、SCG2和SCG3蛋白在U118细胞胞质及突起末端表达丰富。经过PQ诱导后,囊泡数量较对照组明显增多,主要聚集在核周区域,意味着PQ刺激下大量新生的分泌粒蛋白阳性囊泡在内质网合成。9、U118细胞外SCG2蛋白水平较低,而胞浆中大量SCG3蛋白分泌至细胞外间隙。细胞经PQ诱导反应性激活后,单位时间内SCG3蛋白分泌量明显增高。10、SCG3沉默后未见星形胶质细胞特征性因子表达出现稳定改变,而SCG2沉默后,IL-6 m RNA和蛋白水平下降,GS m RNA表达降低,提示U118细胞内SCG2可能与二者表达和运输存在潜在联系。11、免疫荧光共定位分析发现U118细胞中SCG2阳性囊泡与IL-6呈现中等程度共定位,均匀分布在细胞质及突起末端,而与GS共定位程度较低;PQ诱导后U118细胞中SCG2与IL-6的共定位水平增高,尤其在细胞核周围明显,结合前期蛋白免疫印迹结果,表明新生的SCG2囊泡可能参与U118细胞中IL-6的靶向运输和分泌,而SCG2仅在转录水平调节GS的表达。12、U118细胞中SCG3阳性囊泡与BDNF呈现中等程度共定位,分布于细胞质及突起末端,而与IL-6共定位程度较低;PQ诱导后U118细胞中SCG3与BDNF共定位程度增高,推测SCG3阳性囊泡可能部分参与了U118细胞中BDNF的靶向运输和分泌。结论:1、PQ剂量和时间依赖性地诱导U118细胞生存活力下降,使细胞发生反应性激活和迟发性凋亡。2、PQ诱导反应性激活的U118细胞内多种星形胶质细胞特征性因子表达水平增高,细胞发生S期细胞周期阻滞。3、PQ诱导反应性激活条件下,U118细胞内SCG2和SCG3基因及蛋白表达水平均显著上升。4、PQ诱导的反应性激活的U118细胞中SCG2和SCG3阳性囊泡数量明显增加,亚细胞分布改变,在核周区域大量聚集。SCG3蛋白外分泌水平上升。5、U118细胞中SCG2在转录水平调节GS表达,SCG2阳性囊泡部分参与IL-6的表达、运输和靶向分泌过程;SCG3不参与研究中所检测的星形胶质细胞特征性因子的表达调节,但SCG3阳性囊泡可能在BDNF蛋白的靶向运输和分泌中发挥作用。