米多霉素是一种由链霉菌发酵产生的核苷类抗生素,对真菌细胞具有强烈的抑制及杀死作用,特别是对农作物的白粉病有很好的防治效果,而且具有高效、低毒等特点。米多霉素已经在国外实现商品化生产,我国还未进行研究。本论文以提高发酵法生产米多霉素的水平为目标,对米多霉素发酵的菌种改造、培养基成分和培养条件优化及发酵动力学等进行了深入细致的研究,大幅度提高了米多霉素的产量,为发酵法生产米多霉素的工业化奠定了良好的基础。 本论文取得了如下主要进展: 建立了以红酵母AS2.166为敏感菌、土豆葡萄糖培养基(pH7.0)为检定培养基的米多霉素生物检定法。基于这一生物检定技术,设计出简便易行、成本低廉、省时省力的琼脂块初筛法,并用于米多霉素产生菌的高通量筛选。 根据米多霉素的生物合成途径,对米多霉素野生型产生菌MIL01进行推理选育,获得了一株米多霉素高产菌MIL29,米多霉素产量达到了1010 mg/L,为出发菌株MIL01产量的2.6倍。 对米多霉素产生菌MIL29的原生质体制备和再生条件进行了优化,在最适条件下,原生质体的浓度和再生率均比优化前提高了约1.6倍。考察了不同浓度和不同分子量的聚乙二醇对原生质体融合频率的影响,结果表明,40%的聚乙二醇6000是最适的融合剂,最适融合时间为5min。对MIL29的原生质体进行诱变处理后获得菌株MIL32,米多霉素产量较MIL29提高了约9%。 基于全基因组重排理论,通过两轮的多亲本原生质体融合获得了高产菌株MILS9,米多霉素产量分别比MIL32提高了约77%,达到了1950mg/L。 筛选获得了多种促进米多霉素生物合成的前体物质,其中80mmol/L N,N-二甲基乙酰胺和150mmol/L氯化胆碱组成的复合前体能加快糖、氨基氮的消耗速度和米多霉素的合成速度,促使米多霉素的合成时间提前,将米多霉素产量提高至少12%。利用Plackett-Burman设计法考察了培养基组分和发酵条件对米多霉素生物合成的影响,从10个因素中选出3个对米多霉素生物合成最为重要的因素:玉米淀粉、氯化胆碱和N,N-二甲基乙酰胺。响应曲面分析结果进一步证实了氯化胆碱和N,N-二甲基乙酰胺对米多霉素生物合成具有协同促进作用。在优化后的实验条件下获得米多霉素的摇瓶产量达到2607mg/L,比优化前提高了13%。 在10L搅拌式发酵罐中考察了米多霉素的间歇发酵、分批补料发酵和流加发酵特征。实验表明,分批补料发酵可以解决间歇发酵后期营养物质耗竭所导致的米多霉素合成受限问题,米多霉素产量比间歇发酵提高了约38%。流加发酵