研究背景阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, AD)是老年人常见的神经系统变性疾病,在特定脑区形成老年斑(senile plaque, SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)及神经元和突触缺失是其特征性病理改变。该病发病机制十分复杂,在AD脑中淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)主要经β-分泌酶(β-secretion enzyme 1, BACE1)、γ-分泌酶的主要活性成分-早老素(presenilinl, PS-1)的作用裂解为p-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)。Aβ是SP的主要成分,是诱发AD发生和发展的关键因素。关于APP异常代谢及Aβ生成的调控机制方面国内外多项研究取得了突破性的进展,但其具体机制仍然不十分明确。结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor, CTGF)是一种在多种细胞中都能表达的富含半胱氨酸的分泌性多肽。其含有349个氨基酸,Mr约为38 000,属于即刻早期基因家族CNN成员之一。在正常情况下,CTGF在机体内无表达或是仅少量表达。但大量研究证实,在病理状态下,CTGF在多种纤维化疾病的发生和发展中起重要作用,如皮肤、肾、肺、肝、心、视网膜、大血管等。近年来,有学者研究发现,AD患者脑内SP和NFT中CTGF高表达,主要集中在其中的星形胶质细胞和神经元中,并且随病情加重而增加;zhao等研究发现,AD患者脑中CTGF表达水平随病情进展而增加,并通过体外实验证明CTGF可通过上调γ-分泌酶调控APP的异常代谢并促进Ap生成增加,从而说明CTGF可能是参与AD的发生和进展的重要因素之一。但是,AD患者脑中CTGF表达增加的原因尚不清楚,而CTGF促进APP异常代谢及Aβ生成增加的机制也仍不十分明确。糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是糖的醛基和蛋白质的氨基酸经非酶糖基化反应(Maillard反应)生成的一类终末不可逆聚合物,能介导多种病理过程。近年来众多研究表明,AGEs参与阿尔茨海默病脑内异常交联沉积,氧化应激,炎性反应,神经元丧失等病理过程。但AGEs及其受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)在阿尔茨海默病发生和发展中的具体机制尚未阐明。AGEs是否对APP及Ap生成有影响罕有报道。目前国内外研究证实,在肾脏、血管及视网膜组织中AGEs都能够促进CTGF的表达。因此我们考虑,在AD患者脑中AGEs是否也能够促进CTGF的表达增加并通过一定的通路影响APP异常代谢及Ap生成,进而促进AD的进展。因此我们首次选择AGEs-RAGE-CTGF通路对AD进行研究,在细胞水平上探讨AGEs在AD发病中的作用及其可能的机制,证明AGEs-RAGE-CTGF通路可能是AD发生和发展的又一机制,从而为AD的靶向治疗提供必要的理论依据。目的(1)探讨AGEs通过与其特异性受体(RAGE)结合对体外培养的SH-SY5Y细胞CTGF的表达、APP异常代谢及Ap生成的影响。(2)探讨CTGF与SH-SY5Y细胞内APP代谢的相关性及其可能的作用机制。(3)明确AGEs-RAGE-CTGF通路在AD发生和发展中分子病理学机制及作用。方法以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分为7组,正常对照组(NC组,加入生理盐水)、牛血清白蛋白对照组(BSA组,加入牛血清蛋白200μg/mL)、糖基化牛血清白蛋白组(AGEs-BSA组,加入AGEs-BSA, 200μg/mL)、AGEs-BSA+抗RAGE中和抗体组(AGEs-RAGE-Ab组,先加入单克隆中和抗体RAGE-Ab,1:100,1小时后再加入AGEs-BSA,200μg/mL), RAGE中和抗体对照组(RAGE-Ab组,加入单克隆中和抗体RAGE-Ab,1: 100), AGEs-BSA+抗CTGF中和抗体组(AGEs-CTGF-Ab组,先加入单克隆中和抗体CTGF-Ab,1:100,1小时后再加入AGE-BSA,200μg/mL), CTGF中和抗体对照组(CTGF-Ab组,加入单克隆中和抗体CTGF-Ab,1:100)。用MTT法观察细胞形态变化以及确定AGEs-BSA的最佳干预时间及浓度。通过ELISA方法检测各组SH-SY5Y细胞分泌Aβ1-40及Aβ1-42的水平；通过免疫细胞化学方法观察各组细胞内APP, RAGE, CTGF和Ap1-40 Ap1-42蛋白表达情况；通过蛋白免疫印记方法检测各组SH-SY5Y细胞内APP、RAGE、CTGF、BACE1及PS-1蛋白生成情况。结果1.不同蛋白浓度的BSA/AGEs-BSA对SH-SY5Y细胞生长状态的影响MTT实验结果显示,200μg/mLAGEs-BSA作用48h后可以导致SH-SY5Y细胞活力下降至正常对照组的50%左右,相同浓度的BSA对SH-SY5Y细胞活力没有明显影响。故本实验选用200μg/mL AGEs-BSA干预细胞48h,与相对应的其它组比较,观察及检测APP、RAGE、CTGF、BACE1、PS-1及Aβ1-40、Aβ1-42的表达与生成。2. ELISA方法检测AGEs-BSAX对SH-SY5Y细胞分泌Aβ1-40、Aβ1-42的影响NC组、BSA组、RAGE-Ab组和CTGF-Ab组各组之间相比较其上清液中Aβ1-40、Aβ1-42的水平无明显差异；在AGEs-BSA组中其上清液中Aβ1-40、Aβ1-42的水平明显高于NC组；而AGEs-RAGE-Ab组和AGEs-CTGF-Ab组中其上清液中Aβ1-40、Aβ1-42的水平较AGEs-BSA组明显减弱,但仍较NC组明显增加。3.免疫细胞化学法观察各组细胞内APP、RAGE、CTGF、的表达镜下观察AGEs-BSA组中SH-SY5Y细胞胞膜及胞浆中APP、RAGE、CTGF、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白呈棕黄色阳性表达。与AGEs-BSA组相比,NC组、BSA组、RAGE-Ab组和CTGF-Ab组细胞胞膜及胞浆中APP、RAGE、CTGF、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白仅少量表达,着色浅,4组相比较蛋白表达无明显差异；AGEs-RAGE-Ab组细胞膜及胞浆中APP、CTGF、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表达降低,着色较浅,但仍明显高于NC组；AGEs-CTGF-Ab组细胞膜及胞浆中APP、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表达降低,着色较浅,RAGE表达无明显差异,但各指标仍明显高于NC组。4.蛋白免疫印迹检测各组SH-SY5Y细胞中APP、RAGE、CTGF、BACE1、PS-1的蛋白表达并进行半定量分析(1) NC组、BSA组、RAGE-Ab组和CTGF-Ab组各组之间相比较APP、BACE1、PS-1蛋白表达水平无明显差异；在AGEs-BSA组中APP、BACE1、PS-1蛋白表达水平明显高于NC组(P<0.05),分别是NC组的1.49倍、1.76倍和2.03倍；而AGEs-RAGE-Ab组中APP、BACE1、PS-1蛋白表达水平较AGEs-BSA组明显减弱,下降率分别为18.26%、14.88%和29.51%(P<0.05),但仍较NC组明显增加,分别是NC组的1.22倍、1.51倍和1.43倍；AGEs-CTGF-Ab组中APP、BACE1、PS-1蛋白表达水平较AGEs-BSA组明显减弱,下降率分别为14.05%、10.69%和31.03%(P<0.05),但仍较NC组明显增加,分别是NC组的1.45倍、1.60倍和1.21倍。(图9,10,11)(2) NC组、BSA组和CTGF-Ab组3组之间相比较RAGE蛋白表达水平无明显差异；在AGEs-BSA组和AGEs-CTGF-Ab组中RAGE蛋白表达水平明显高于NC组(P<0.05),分别是是NC组的1.42倍和1.44倍；AGEs-BSA组和AGEs-CTGF-Ab组相比RAGE蛋白表达水平无明显差异。(图12)(3) NC组、BSA组、RAGE-Ab组各组之间相比较CTGF蛋白表达水平无明显差异；在AGEs-BSA组中CTGF蛋白表达水平明显高于NC组(P<0.05),是NC组的1.98倍；而AGEs-RAGE-Ab组中CTGF蛋白表达水平较AGEs-BSA组明显减弱,下降率分别为30.29%(P<0.05)；但仍较NC组明显增加,是NC组的1.38倍。(图13)结论1.在细胞水平上,AGEs上调其特异性受体RAGE的表达,并通过与RAGE结合促进SH-SY5Y细胞CTGF的表达、APP异常代谢及Aβ1-40、Aβ1-42的生成增加。2. CTGF通过影响APP代谢酶(BACE1、PS-1)的作用参与APP的异常代谢及促进Aβ1-40、Aβ1-42的生成。3. AGEs-RAGE-CTGF通路上调可能是AGEs促进SH-SY5Y细胞损伤的重要信号途径,可能是参与阿尔茨海默病(AD)发生与发展的机制之一。意义本研究应用AGEs体外干预SH-SY5Y细胞,建立AGEs细胞损伤模型,用免疫细胞化学、ELISA和蛋白免疫印迹方法观察AGEs对APP、RAGE、CTGF、BACE1、PS-1的表达和Aβ生成的影响；并通过进一步阻断RAGE及CTGF的作用,检测以上各项指标的变化,探讨AGEs通过作用其特异性受体RAGE诱导CTGF表达对APP异常代谢及Aβ生成的相关性。初步证明AGEs-RAGE-CTGF通路可能是参与AD发生和发展的机制之一,从而为AD的诊治提供了一种新的思路方法。