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目的:通过慢性根尖周炎临床样本、破骨细胞炎症环境、成骨细胞炎症环境三个方面,研究PI3K在慢性根尖周炎中的表达情况,探讨PI3K在慢性根尖周炎骨破坏过程中的作用,为慢性根尖周炎的治疗提供参考依据。方法:收集临床慢性根尖周炎患者根尖周组织样本、建立LPS介导的破骨细胞水平炎症环境和成骨细胞水平炎症环境,研究PI3K及相关因子的表达情况。1.检测临床样本中PI3K及破骨相关因子的基因表达水平Real-Time PCR研究26例慢性根尖周炎组织和10例健康根尖周组织中PI3K、TRAP及NFATc1的基因表达水平。2.PI3K在破骨细胞中的表达情况(1)诱导RAW264.7分化为破骨细胞将破骨细胞前体RAW264.7细胞培养至第三代,用0.1μg/ml RANKL诱导液进行诱导5天,分别采用光学显微镜、TRAP染色及Real-Time PCR检测TRAP基因进行破骨细胞验证。(2)LPS介导的炎症环境下,在破骨细胞中PI3K及破骨相关因子表达情况100 ng/ml LPS作用于破骨细胞,Real-Time PCR和Western Blot分别检测PI3K、TRAP及NFATc1基因及蛋白表达水平。(3)PI3K抑制剂对破骨细胞增殖、分化及PI3K/Akt信号通路的作用影响用PI3K抑制剂LY294002作用于破骨细胞,通过CCK-8法检测细胞增殖活性。Real-Time PCR检测Akt及TRAP、NFATc1基因表达水平。Western Blot检测Akt、p-Akt及TRAP、NFATc1蛋白表达水平。3.PI3K在成骨细胞中表达情况(1)诱导MC3T3-E1分化为成骨细胞将成骨细胞前体MC3T3-E1细胞培养至第三代,成骨诱导液诱导7天,通过ALP染色及Real-Time PCR检测ALP基因进行成骨细胞验证;成骨诱导液诱导21天,通过茜素红染色进行成骨细胞验证。(2)LPS介导的炎症环境下,在成骨细胞中PI3K及成骨相关因子表达情况1000 ng/ml LPS作用于成骨细胞,Real-Time PCR和Western Blot分别检测PI3K、BMP2及Runx2基因及蛋白表达水平。(3)PI3K抑制剂对成骨细胞增殖、分化及PI3K/Akt信号通路的作用影响抑制剂LY294002作用于成骨细胞,通过CCK-8法检测细胞的增殖活性。Real-Time PCR检测Akt、BMP2及Runx2基因表达水平。Western Blot检测Akt、p-Akt及BMP2、Runx2蛋白表达水平。结果:1.PI3K、TRAP及NFATc1在临床样本中表达情况与健康牙周膜组织相比,慢性根尖周炎样本组中PI3K、TRAP及NFATc1基因表达增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.PI3K在破骨细胞中的表达情况(1)RANKL诱导液诱导5天后,通过光学显微镜、TRAP染色及Real-Time PCR检测TRAP基因发现破骨细胞诱导成功。(2)Real-Time PCR结果显示在实验组中PI3K、TRAP及NFATc1的m RNA水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示PI3K、TRAP及NFATc1的蛋白水平的表达与Real-Time PCR结果相一致,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)CCK8结果显示PI3K抑制剂作用于破骨细胞后在24小时和48小时的增殖活性较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Real-Time PCR结果显示实验组中PI3K、TRAP及NFATc1的m RNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示实验组中p-Akt/Akt蛋白比降低以及TRAP、NFATc1的蛋白水平的表达情况与Real-Time PCR结果相一致,差异有统计学意义(P<0.05)。3.PI3K在成骨细胞中的表达情况(1)分别用成骨诱导液诱导7天及21天后,分别通过ALP染色、Real-Time PCR检测ALP基因及茜素红染色发现成骨细胞诱导成功。(2)Real-Time PCR结果显示在实验组中PI3K、BMP2及Runx2的m RNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示PI3K、BMP2及Runx2的蛋白水平表达与Real-Time PCR结果相一致,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)CCK8结果显示PI3K抑制剂作用于成骨细胞后在24小时和48小时的增殖活性较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Real-Time PCR结果显示实验组中PI3K、BMP2及Runx2的m RNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示实验组中p-Akt/Akt蛋白比降低及BMP2、Runx2的蛋白水平的表达情况与Real-Time PCR结果相一致,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.PI3K在慢性根尖周炎中的基因表达水平增高。2.在脂多糖LPS介导的炎症环境下,PI3K在破骨细胞中的表达增高,在成骨细胞中的表达降低。3.抑制PI3K,影响了破骨细胞和成骨细胞的增殖、分化,PI3K通过调控破骨细胞和成骨细胞的增殖、分化,参与慢性根尖周炎的发生发展。