阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知障碍、行为异常为主要表现的临床综合征。据最新研究发现我国≥65岁AD总患病率为5.8%(欧美为6.4%),85岁以上患病率为1/3。AD的发病率高于VD等其他类型的痴呆,并与年龄成正相关。据2005年统计全球有2430万痴呆患者,每年新增460万,每7秒全球新增1例患者。2010年世界范围内的痴呆花费约为6040亿美元。痴呆给社会和家庭带来了沉重的精神和经济负担。据统计,老年性痴呆约占老年病死亡原因的第四位,仅次于心脑血管病和癌症。一般AD诊断后存活期在5-20年,目前尚无行之有效的治疗方法,早期诊断及治疗可以改善症状、延缓病程的进展、提高病人的生活质量,减轻社会及家庭经济负担。AD的发病机制尚不清楚,近来研究发现肿瘤坏死因子受体超家族成员CD40与其同源配体CD40L与AD的病理机制关系密切。目前国内对CD40-CD40L通路的研究主要限于冠心病、脑血管病、高血压等血管损伤方面,而国外对该通路与AD的病理机制、诊断及治疗方面研究的较多。CD40-CD40L可以影响Ap的产生及清除,影响Tau蛋白磷酸化,亦可以通过Ap纤维体诱导的小胶质细胞异常活化产生的固有免疫和适应性免疫应答加重神经炎症反应,多种途径启动并促进AD的病理机制的发生发展,进一步加重神经元损伤,阻断该通路可以减轻AD病理损伤。在PSAPP或TgAPPsw转基因鼠/CD40L基因缺陷鼠发现阻断CD40-CD40L可以降低Aβ诱导的炎性反应,减轻神经元损伤。目前认为Aβ1-42寡聚体对神经元的毒性作用最强,在介导炎症反应方面是否也是最强尚不清楚,本实验通过体外建立AD的炎性反应模型,用不同浓度的Aβ1-42单体、寡聚体及纤维体分别干预小胶质细胞及神经元细胞,检测炎症指标的强弱及神经元损伤情况。通过Aβ1-42寡聚体单独或联合CD40L分别干预小胶质细胞,并予抗CD40抗体阻断CD40-CD40L信号通路后,检测各组的炎症反应情况及对神经元的影响,探讨CD40-CD40L信号在Aβ1-42寡聚体诱导的小胶质细胞中的作用,寻找治疗AD的可能的靶点,为后续试验提供理论依据。[材料和方法]1材料：昆明乳鼠(3天以内)购自中山大学实验动物中心(许可证号：SCXK(粤)2009-0011),澳洲胎牛血清(GIBCO), DMEM/F12高糖培养基(GIBCO),神经元无血清培养基(Neurobasal,, GIBCO),B27神经营养因子(GIBCO),胰酶(含EDTA,0.25%,吉诺),多聚L-赖氨酸(Sigma),青链霉素(双抗,Sigma),二甲基亚砜(DMSO,MP Biomedicats),六氟异丙醇(HFIP,Sigma),大鼠抗小鼠FITC标记的CD11b(OX42, eBioscience),鸡抗小鼠神经元特异性烯醇化酶NSE多克隆抗体(Millipore),辣根过氧化物酶(HRP)结合羊抗鸡抗体(Santa Cruz Biotechnology),DAB试剂盒(Santa Cruz),人工合成的生物晶体Aβ1-42(Sigma), CD40Ligand(eBioscience), CD40抗体(eBioscience), IFN-γ (eBioscience) FITC-大鼠抗小鼠CD40抗体(eBioscience), FITC-大鼠抗小鼠CD45抗体(BD,61008),PE-大鼠抗小鼠MHCⅡ抗体(eBioscience),同型对照(eBioscience),小鼠TNF-aELLSA试剂盒(达科为生物科技有限公司),小鼠LDH试剂盒(博泰生物科技有限公司)仪器：超净工作台(中国,AIRTECH),细胞培养箱(美国,Thermo Foma)、倒置显微镜(日本,OLYMAPUS)、流式细胞分析仪(德国,Becton Dickinson),透射电镜(荷兰Philips CM10),低温高速离心机(德国,Beckman), SynerTMHT多通道酶标仪(美国,BIO TEK),消毒手术器械2方法：2.1细胞培养2.1.1原代小胶质细胞培养：新生乳鼠无菌条件下取出大脑皮质,放入预D-Hanks液清洗2次,小心剥离脑膜和血管,0.125%的胰酶消化37℃,15min,终止后过滤,离心,计数,接种(DMEM/F12高糖培养基,含1%青、链霉素、20%胎牛血清)。24小时后全量换液、之后三天换液一次,至7-9天胶质细胞分层。上层细胞为圆形或椭圆,主要是小胶质细胞、少突胶质细胞,下层细胞连成片主要是神经元、星形胶质细胞。轻轻摇晃培养瓶5min,收集上层细胞,半小时内差速贴壁法进一步纯化小胶质细胞。流式细胞术鉴定小胶质细胞表面CD11b,阳性率大于95%,可以用于实验。2.1.2原代神经元细胞培养：取材接种同原代小胶质细胞培养,不同的是第二天更换无血清神经元培养基(含1%青、链霉素,含2%B27神经营养因子),三天一次换液,4-5天左右形成神经网络结构,NSE免疫细胞化学染色鉴定,五个显微镜视野下,平均每个视野棕黄色细胞数占总细胞数的90%以上。2.2Aβ1-42寡聚体、纤维体、单体制作：将人工合成的Ap1-42晶体0.5mg用六氟异丙醇(HFIP)0.11m1溶解、重悬。室温条件下在通风橱内使HFIP挥发,Aβ1-42形成白色肽膜。然后用20u1二甲基亚枫DMSO溶解,稀释分装。4℃、24小时后即为Aβ42寡聚体；37℃、7天后即为Aβ1-42纤维体；而溶解好的Aβ1-42单体直接保存在-20℃备用。取5u1上述液体滴于含碳支持膜200目去离子铜网上,空气干燥1分钟后,用2%醋酸双氧铀负染1分钟,使用透射电镜鉴定。2.3小胶质细胞炎性模型建立：2.3.1不同浓度的Aβ1-42单体、寡聚体、纤维体对小胶质细胞的致炎作用比较：将分离纯化的原代小胶质细胞以1×105/孔接种到六孔板中24h,分别将浓度为1ug/ml,5ug/ml,10ug/ml的Aβ1-42寡聚体及纤维体加入小胶质细胞,设立对照组,与小胶质细胞共培养24h后,分别收集上清液及细胞,并用夹心ELISA法检测上清液中的TNF-α,取浓度为5ug/ml Aβ1-42寡聚体及纤维体干预过的小胶质细胞,进行流式细胞术检测小胶质细胞表面CD45及MHCII分子。2.3.2将分离纯化的小胶质细胞以1×105／孔接种到六孔板中,采取浓度为5ug/ml的Aβ1-42寡聚体单独及联合2ug/mlCD40L干预组、T细胞参与的适应性免疫应答产物之一γ干扰素(IFN-γ)10ug/ml联合Aβ1-42组,并设立对照,培养24h后检测小胶质细胞TNF-α释放水平及向抗原提呈功能转化情况；将干预过的小胶质细胞上清液继续培养神经元同时将不同干预条件直接培养神经元,分别培养24h检测神经元乳酸脱氢酶(LDH)的释放水平来观察神经元的损伤,随后用2.5ug/ml抗CD40抗体阻断CD40-CD40L通路后,继续观察以上指标的变化。检测各实验组小胶质细胞炎症上清液TNF-α及神经元上清的LDH水平：严格按ELISA试剂盒说明书进行操作。通过流式细胞术检测小胶质细胞表面CD40及MHCII表达。3.统计学处理计量资料均采用结果用x±s表示,应用SPSS13.0进行统计分析,采用析因设计的方差分析及单因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齐性用LSD法,方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较,p<0.05被定为具有统计学意义。[结果]1.原代小胶质细胞的分离培养与鉴定：倒置显微镜下可见小胶质细胞胞体圆形或椭圆形,伸出突起,多而短,也可见细长突起,活化后呈阿米巴样；流式细胞术鉴定纯化后的小胶质细胞,表面CD11b的阳性率在95%以上。2.原代神经元细胞分离培养与鉴定：无血清培养基培养混合细胞4-5天后,胶质细胞因无血清而生长受抑制,神经元开始生长,并被培养基筛选为主要细胞,逐渐伸出轴突树突并开始形成网络结构,免疫细胞化学染色可见细胞为棕褐色,阳性率为90%以上。3.不同形式的Aβ1-42的制作：制作成功的Aβ1-42寡聚体在透射电镜下显示为圆形或椭圆形的立体结构,长度、宽度及高度一般在10nm左右；纤维体为针状纵横交错的淀粉样纤维结构。4.各组小胶质细胞上清液TNF-α的浓度比较：4.1不同浓度及形式的Aβ1-42对小胶质细胞的致炎作用比较：浓度为1ug/ml,5ug/ml,10ug/ml的Aβ1-42单体、寡聚体及纤维体对小胶质细胞干预24h后,各组上清液TNF-α浓度较对照组比较明显升高,具有统计学意义(P<0.05)。各实验组比较,浓度5ug/ml的Aβ1-42干预组TNF-α释放较其他浓度组明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。寡聚体组较单体及纤维体组上清TNF-α释放增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.2CD40L对Aβ1-42寡聚体诱导的小胶质细胞的致炎作用比较：各组上清液TNF-α浓度比较具有统计学意义(P<0.05)。加入CD40L或IFN-γ后与Aβ1-42寡聚体单独干预小胶质细胞比较,上清液中TNF-α释放明显增加,加入抗CD40抗体阻断后,发现上清TNF-α释放减少,各组差异均具有统计学意义(P<0.05)。5.各组小胶质细胞表面CD45、CD40及MHCⅡ分子表达情况比较：5.1不同形式的Aβ1-42小胶质细胞表面表达情况比较：浓度为5ug/ml Aβ1-42寡聚体及纤维体干预小胶质细胞后,流式细胞术检测小胶质细胞表面CD45及MHCⅡ分子,寡聚体组较纤维体组,细胞表面的CD45及MHCⅡ表达更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.2CD40L对Aβ1-42寡聚体诱导的小胶质细胞表面抗原的影响：加入CD40L后小胶质细胞表面CD40及MHCⅡ分子共表达阳性率比单独Aβ1-42干预组高；加入抗CD40抗体后,二者的共表达阳性率较Aβ1-42单独及联合CD40L干预组下降。各实验组差异均具有统计学意义(P<0.05)6.各组神经元细胞上清液LDH的浓度比较：6.1不同浓度及形式的Aβ1-42对神经元的作用比较：浓度为1ug/ml,5ug/ml,10ug/ml的Aβ1-42单体、寡聚体及纤维体直接作用于神经元24h后,ELLSA检测各组上清液中LDH的释放,浓度为5ug/ml不同形式的Aβ1-42干预组与其他浓度比较,LDH释放明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。寡聚体干预组LDH释放增多最明显,其次是纤维体,各组比较具有统计学意义(P<0.05)。6.2各组CD40L及Aβ1-42干预小胶质细胞产生的炎症上清液对神经元的作用比较：干预小胶质细胞的炎性上清液培养神经元后,ELLSA检测各组上清液中LDH的浓度,Aβ1-42+CD40L组与Aβ1-42组单独干预组相比更能刺激神经元LDH的释放,加入抗CD40抗体组较Aβ1-42+CD40L组LDH释放明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。炎症上清液培养神经元,与用Aβ1-42等直接培养神经元比较,LDH释放明显增加,具有统计学意义(P<0.05)[结论]1.Aβ1-42单体、寡聚体及纤维体均可诱导小胶质细胞产生炎症反应(包括固有免疫及适应性免疫应答),其中,寡聚体的致炎症效应最强。2.Aβ1-42单体、寡聚体及纤维体均可诱导神经元的损伤,但致炎后对神经元的损伤更明显。3.CD40L可以增强Aβ1-42寡聚体诱导的炎症反应,促进小胶质细胞介导的固有免疫,促进小胶质细胞向抗原提呈功能转化,加重神经元的损伤。抗CD40抗体可以有效阻断上述炎症反应。说明CD40L与Aβ1-42寡聚体在促进炎症反应方面具有协同作用。