目的:肺癌是导致人类肿瘤相关致死的主要肿瘤类型,同时也是脑转移肿瘤的主要来源,尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),几乎占据了一半的脑转移病例。虽然对肺癌的治疗已经取得了相当大的进步,但是患者的生存预后仍不乐观,尤其是肺癌的复发与转移严重地影响着病人的生活质量和生存时间。尽管免疫检查点抑制剂的应用极大地推动了肿瘤免疫治疗的发展与推广,然而较为明显的免疫相关副作用以及应用局限性在一定程度上阻碍了其进一步的发展与应用。因此,有必要更进一步地探索肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)与肿瘤细胞之间的相互关系及影响机制,挖掘微环境重塑的相关因子。尤其是肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment,TIME)与肿瘤细胞间的相互作用与影响获得普遍的关注,例如研究发现肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)与NSCLC患者的5年生存率显著相关,肿瘤中低丰度的浸润淋巴细胞是早期NSCLC不良预后的指标。正是这种临床上的相关性研究促进了免疫治疗的发展,推动了免疫检查点抑制剂在NSCLC治疗中的应用。Ibrutinib是一种小分子BTK特异性抑制剂,在对骨髓源性造血细胞恶性肿瘤的治疗中取得了良好的疗效。近年来,ibrutinib的应用已经推广到某些实体瘤的治疗中,如肺癌和胰腺癌等,然而却未收到显著疗效,并且对其原因和相关机制并不清楚。随着科技的进步,尤其是测序技术的发展,极大地推动了对基因的遗传表达及功能等方面的研究,一定程度上加速了生物学和医学向大数据时代的迈进。RNA-Seq等测序技术高效短时地产生大量数据,因此极大地推动了具有典型多学科综合特点的生物信息学在生物学和医学研究中的广泛应用。尤其是在肿瘤研究领域,伴随着TCGA(The Cancer Genome Atlas),GEO(Gene Expression Omnibus)等数据库地建立和完善,越来越多的与疾病相关的基因研究数据和患者临床信息数据被整理收录于相应数据库中,为疾病全面深入地研究与分析提供了充分客观的数据支持。因此,借助生物信息学对大量临床测序样本的综合性分析有助于更全面更深入的理解肿瘤疾病的发生发展规律,从而为肿瘤的防治提供更为精准的方案和药物靶点。研究方法:本研究通过对TCGA肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)临床样本转录组RNA-Seq数据的生物信息学分析,挖掘对患者生存和疾病发展具有预后作用的肿瘤微环境相关因子。通过ESTIMAT算法分别推算样本组织肿瘤微环境中免疫和基质组分的含量。联合患者的临床信息数据,利用Kaplan-Meier方法对不同免疫和基质含量的样本进行生存分析,意图评估免疫和基质组分的含量与患者生存的相关性。分别对微环境中不同含量比例的免疫组分和基质组分的样本进行基因差异表达分析,挖掘与肿瘤微环境中与免疫和基质组分相关的差异基因(Differentially Expressed Gene,DEG)。在获得与免疫和基质组分有关的差异基因集后,借助GO(Gene Ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库中的注释信息对差异基因进行富集分析。通过STRING数据中的蛋白质互作信息构建蛋白质互作网络,并利用Cytoscape对互作网络进行重构,提取其中的核心网络。通过对差异基因的单因素COX回归分析明确与患者生存预后相关因子,并通过与蛋白互作网络核心节点的交集分析进一步挖掘与肿瘤微环境重塑的相关因子。通过基因的差异表达分析,明确BTK在正常组织与肺腺癌原位瘤组织间的差异表达。通过生存分析和相关性分析探索BTK的表达与肺腺癌患者生存及病理分期相关性。利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)分别对BTK高表达肿瘤样本与低表达样本中所有表达基因进行富集分析,从转录组整体层面分析BTK与肺腺癌肿瘤微环境整体代谢状态的相关性。利用CIBERSORT算法评估肿瘤浸润免疫细胞(tumor-infiltrating immune cell,TIC)的类型及丰度,并通过差异性分析和相关性分析探索BTK与TIC的相关性。下载GEO数据库中GSE110495数据集中肺癌脑转移不同阶段的基因表达数据,对脑转移不同阶段内BTK的表达进行差异分析,探索BTK与肺癌脑转移过程的相关性。通过Real-time PCR和Western Blot分析BTK在mRNA和蛋白质水平的表达量。利用小鼠颈内动脉(Internal Carotid Artery,ICA)注射手术建立肺癌脑转移动物模型。借助重组慢病毒转染脑转移肺癌细胞后,通过ICA注射手术将其注入小鼠脑内,利用双光子激光共聚焦扫描显微镜观察肿瘤细胞脑内成瘤。利用Transwell共培养脑转移肺癌细胞与巨噬细胞,探索肺癌细胞对巨噬细胞中BTK表达的影响。结果:在本实验中,通过对TCGA数据库中肺腺癌样本转录组RNA-Seq测序数据的一系列生物信息学分析发现,BTK是肺腺癌患者生存和疾病发展的潜在预后因子,并且是肿瘤微环境重塑的潜在指示因子,其表达的下调标志着肿瘤微环境由免疫反应转变为增殖代谢为主的重塑。BTK与TIC的差异相关性分析显示,BTK的表达与TME中多种TIC的类型和丰度有关,例如BTK与CD8~+T细胞的含量呈显著正相关性,与M0巨噬细胞呈负相关,结果进一步提示BTK与TME的重塑相关。同时在对GEO数据库中肺癌脑转移相关研究的基因表达RNA-Seq测序数据分析发现,随着肺癌细胞脑转移过程中各个阶段的发展,BTK的表达逐渐下调。通过颈内动脉注射手术建立小鼠肺癌脑转移动物模型,从成瘤小鼠脑内提取并培养脑转移肺癌细胞。通过对脑转移肺癌细胞BTK的表达分析发现,随着脑转移肺癌细胞增殖能力及颅内成瘤能力的升高,肿瘤细胞及与其共培养巨噬细胞中BTK的表达显著下调。实验和分析结果在一定程度上解释了BTK抑制剂ibrutinib对肺癌临床治疗效果不显著的原因,为肺癌的临床治疗提供新的方向和靶点,同时为肿瘤细胞与肿瘤微环境互作的进一步研究与探索提供新的研究思路与视角。结论:1、BTK的表达与肿瘤微环境重塑有关,高表达BTK的肿瘤微环境主要以免疫反应为主,而BTK低表达的微环境则以肿瘤相关代谢为主。2、BTK的表达水平与肿瘤微环境中浸润免疫细胞的类型和比例有关,如与M0巨噬细胞的含量比例呈负相关性,与CD8~+T细胞呈正相关。3、BTK的表达水平与肺腺癌患者的生存预后呈正相关性,BTK高表达患者的中位生存时间大于低表达患者;同时随着临床病理分期的升高,BTK的表达呈下降趋势,与stage和T分期具有统计学显著负相关性。4、随着肺癌脑转移过程的发展,从原位肿瘤到脑转移瘤形成,BTK的表达逐渐下调。5、利用小鼠颈内动脉注射手术将肺癌细胞多次送入小鼠脑内,随着脑内微环境的反复作用,脑转移肺癌细胞的增殖能力显著增强,肺癌细胞及与其共培养的巨噬细胞中BTK的表达显著下降。