葡萄糖氧化酶发酵条件的优化、纯化及酶制剂研究

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葡萄糖氧化酶能够氧化葡萄糖产生葡萄糖酸,并且利用分子氧作为电子受体同时产生过氧化氢,因此在食品、医药、饮料和化工等行业有广泛的应用。本文主要研究了黑曲霉产葡萄糖氧化酶的发酵条件、葡萄糖氧化酶的纯化及部分酶学性质和葡萄糖氧化酶的固体酶制剂。为了提高本实验室筛选保藏的黑曲霉M2632发酵法产葡萄糖氧化酶的产量,通过单因素实验得到黑曲霉产葡萄糖氧化酶的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为(NH42HPO4,吐温80对产酶的促进作用最强,通过均匀设计得到最佳发酵培养基为:葡萄糖162.4g/L、(NH42HPO41.2g/L、KH2PO45.7g/L、MgSO4·7H2O6.3g/L、CaCO356.9g/L;经单因素实验得到了最适发酵培条件为:温度为32℃,pH为7.0,接种量为6%,转速为200r/min,种龄为18h;以上述条件在5L发酵罐中发酵得到葡萄糖氧化酶的产酶曲线,在发酵时间为48h时获得最大产酶效率。黑曲霉发酵法产葡萄糖氧化酶的纯化方法进行研究,最终选择的纯化方法为:饱和度30%~80%的硫酸铵分级盐析、透析、DEAE-Sephrose离子交换柱层析、Superdex-G200凝胶柱过滤,经四步纯化纯化倍数达到30.22倍,回收率为31.58%,酶液经过SDS-PAGE凝胶电泳呈现单一条带,达到电泳纯,该酶相对分子质量为154.2kD,含有两个相同亚基;对部分酶学性质进行研究可得:反应的最适温度为40℃,热稳定性范围为20℃到45℃;反应的最适pH为5.5,pH稳定性范围为3.5到7.0;Na+、Zn2+、Ca2+对葡萄糖氧化酶活力具有促进作用,Hg2+、Ag+对酶活力有强烈的抑制作用,5mmol/L的Mg2+对葡萄糖氧化酶有促进作用,高浓度的Mg2+则对酶活力起抑制作用,K+、Cu2+、Fe2+对酶活力有轻微的抑制作用。考察了3种助干剂(可溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精)和4种保护剂(蔗糖、海藻糖、氯化钠、聚二乙醇1000)对酶活力回收率的影响,结果显示:当添加麦芽糊精时可以大幅度提高酶的热稳定性,加入麦芽糊精调节固形物含量为15%时,酶活力回收率最高,海藻糖为保护剂时,能够很好的保持葡萄糖氧化酶的空间结构,最适添加量为0.3%;通过单因素试验对喷雾干燥的主要工艺参数进行优化,确定了固体酶制剂的最佳喷雾干燥条件为:进风温度170℃,出风温度80℃,流速8mL/min。
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