肿瘤坏死因子α（TNF-α）分为两型：跨膜型 TNF-α（tmTNF-α）和分泌型 TNF-α（sTNF-α）。tmTNF-α表达在淋巴细胞，活化的巨噬细胞等细胞表面，剪切后分泌到细胞外，即 sTNF-α。两型 TNF-α均可导致肿瘤细胞凋亡，但 tmTNF-α能诱导抵抗sTNF-α的肿瘤细胞凋亡，提示两型TNF-α凋亡信号通路可能不同。本实验室已证实两型 TNF-α都可以通过和 TNFR1结合进而介导细胞凋亡，但 tmTNF-α不能引起TNFR1的内化，也不依赖TNFR1的DD和NSD传递死亡信号，但其机制尚不清楚。　　此外，tmTNF-α也可传递反向信号：即作为配体向细胞内传导信号。本实验室已证实tmTNF-α通过其反向信号诱导NF-κB经典途径组成性活化，上调抗凋亡分子，使肿瘤细胞耐药并抑制凋亡，但其具体分子机制不详。　　本研究拟探索tmTNF-α通过正向信号介导凋亡和tmTNF-α通过反向信号保护肿瘤细胞抵抗凋亡的分子机制。其主要研究结果如下：　　一、 tmTNF-α促凋亡正向信号转导机制的研究　　1.两型TNF-α在细胞不同部位通过TNFR1形成DISC复合物　　分别用tmTNF-α或sTNF-α作用TNFR1高表达的U937细胞30min，提取总蛋白进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)证实：两型TNF-α均可通过TNFR1募集TRADD、FADD和Caspase8，形成DISC复合物。随后收集刺激后的细胞（同上），提取细胞膜和细胞浆蛋白进行Co-IP证实：sTNF-α诱导TNFR1在胞浆中形成DISC，而tmTNF-α则诱导TNFR1在胞膜上形成DISC。　　2. sTNF-α通过TNFR1激活NF-κB，而tmTNF-α则不能　　分别用tmTNF-α或sTNF-α作用TNFR1高表达的U937细胞30min，提取细胞膜蛋白，Co-IP实验结果可见sTNF-α作用TNFR1后，可以在细胞膜上募集形成信号复合物I,而tmTNF-α则不能。用Western blot证实sTNF-α可诱导IκB-α降解，激活经典NF-κB通路，而tmTNF-α则无此效应。用MTT实验证实两型TNF-α均有胞毒效应，用PDTC抑制NF-κB活化，对tmTNF-α的杀伤作用无影响,仅能促进sTNF-α对肿瘤细胞的杀伤作用。　　3. tmTNF-α以DD非依赖方式诱导TNFR1募集STAT1和DISC分子　　分别将含 wild-type TNFR1和ΔDD-TNFR1突变体基因的真核表达载体转染至293T细胞，两型TNF-α刺激30 min后，用TNFR1单抗对总蛋白或胞膜蛋白进行免疫共沉淀，结果证实：与wild-type TNFR1相比，ΔDD-TNFR1使sTNF-α诱导TNFR1募集STAT1减少，并不能募集DISC复合物，然而却不影响tmTNF-α诱导TNFR1募集STAT1和DISC的形成。在胞膜上sTNF-α不能诱导TNFR1及其突变体募集STAT1，而tmTNF-α则可为之，并形成DISC，且不受缺失DD的影响。　　4. STAT1为tmTNF-α/TNFR1介导凋亡信号及其胞毒效应所必需　　tmTNF-α可诱导表达STAT1的HT1080细胞形成大量TNFR1/DISC复合物，却使STAT1缺陷细胞株U3A形成TNFR1/DISC明显减少；用siRNA下调HT1080细胞STAT1基因表达或转染U3A细胞STAT1基因可分别抑制或增强tmTNF-α的凋亡信号。用MTT实验证实tmTNF-α对HT1080有明显的胞毒效应，却对U3A细胞杀伤能力明显减弱，转染STAT1可恢复tmTNF-α的胞毒效应。体内荷瘤实验证实注射tmTNF-α质粒可明显抑制HT1080肿瘤的生长，促进肿瘤细胞凋亡，但对STAT—的U3A肿瘤的生长则无明显抑制作用。　　5.确认tmTNF-α诱导TNFR1与STAT1结合的位点　　利用PCR获得Δ338-455-TNFR1，Δ319-455-TNFR1和Δ266-455-TNFR1等3种不同的胞浆段截短型TNFR1突变体，并转染293T细胞，用tmTNF-α刺激30 min，结果证实只有野生型TNFR1和Δ338-455-TNFR1突变体可募集STAT1，其他2种突变体则不行，提示STAT1与TNFR1的318~337位氨基酸结合。此外，转染Δ338-455-TNFR1突变体，只有tmTNF-α，而非sTNF-α，可诱导STAT1与之结合，提示sTNF-α诱导TNFR1募集STAT1是间接的。　　6. STAT1 S727磷酸化是tmTNF-α诱导TNFR1募集DISC所必需　　用两型TNF-α刺激U937细胞30min，Western blot证实sTNF-α诱导STAT1的Y701磷酸化，而tmTNF-α则刺激STAT1的Y701和S727均发生磷酸化；转染S727A可完全阻断tmTNF-α诱导TNFR1募集DISC分子。　　结论：与sTNF-α不同，tmTNF-α通过TNFR1募集STAT1,进而募集TRADD与其他DISC分子，诱导细胞凋亡，且不激活NF-κB，显示比sTNF-α杀瘤的优越性。　　二、 tmTNF-α抗凋亡反向信号通路的研究　　本室前期工作证实tmTNF-α通过反向信号诱导肿瘤细胞组成性活化NF-κB经典途径，导致肿瘤细胞抵抗凋亡而耐药。但是，tmTNF-α通过其反向信号激活经典NF-κB的机制尚不清楚。本研究初步证实：　　1. tmTNF-α不募集NF-κB经典途径的分子　　提取Raji细胞总蛋白，并用本室自制的tmTNF-α单抗进行Co-IP，证实tmTNF-α不能与RIP1、TRAF2、TRAF3、TAK1、IKKβ和p65等NF-κB经典途径分子发生共沉淀，只能与IKKα（可参与NF-κB非经典途径）发生共沉淀，提示tmTNF-α不能通过募集NF-κB经典途径的上游分子激活NF-κB经典途径。　　2. tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典途径　　转染wild-type tmTNF-α或TNF-LS（缺失胞外段）至293T细胞，用Western blot证实二者均可导致IκB降解，cIAP1增加，以及NF-κB负性调控分子CYLD减少。再次证实tmTNF-α可通过其反向信号激活NF-κB经典途径。　　3. tmTNF-α反向信号通过Akt途径激活NF-κB　　转染wild-type tmTNF-α或TNF-LS（缺失胞外段）至293T细胞，用Western blot证实二者均可导致Akt磷酸化增加，提示tmTNF-α反向信号可活化Akt途径。用Akt抑制剂LY294002抑制Akt磷酸化,则可阻断tmTNF-α反向信号诱导的IκBα降解，提示tmTNF-α通过Akt途径激活NF-κB经典途径。　　4. tmTNF-α反向信号可能直接激活Akt　　分别提取Raji细胞总蛋白和转染TNF-LS的293T细胞总蛋白，免疫共沉淀实验证实tmTNF-α可与Akt发生共沉淀，却不能与其上游信号分子PI3K发生共沉淀，提示Akt存在于tmTNF-α反向信号复合物中，但是Akt磷酸化机制尚不明确，还需进一步实验研究。　　结论：本研究结果初步证实tmTNF-α反向信号可通过Akt诱导NF-κB经典途径的活化。但是，tmTNF-α反向信号活化Akt的分子机制尚需进一步研究。　　本研究在分子水平阐明了tmTNF-α通过TNFR1诱导凋亡的信号通路，并初步证实tmTNF-α反向信号间接活化NF-κB经典途径，促进肿瘤细胞生存。为认识tmTNF-α正向和反向信号转导通路提供实验依据，为临床肿瘤治疗提供新的思路与靶点。