论文部分内容阅读
结核病(Tuberculosis,TB)是当前人类面临的最严重的公共卫生安全威胁之一,也是全球十大死因之一。据世界卫生组织(WHO)2018年全球结核病报告数据显示,全球新发结核病患者约1010万,估算结核病死亡人数约为157万。结核病防控所面临的挑战主要包括以下两个方面:一方面,结核病的耐药形势日趋严峻:据WHO估算,2017年全球新发耐多药结核病(Multidrug resistant-tuberculosis,MDR-TB)约 46 万例。MDR-TB 治疗难度大、治疗周期长、且治愈率低,急需研发新的抗结核药物来应对日益严重的结核病耐药形势。另一方面,结核潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)情况更是不容乐观。据WHO统计,全球有四分之一的人口属于LTBI人群,我国也有近3.6亿人口处于LTBI,LTBI是活动性肺结核的重要来源之一,急需建立阻止其发展成为活动性肺结核的策略。毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统广泛存在于细菌和古细菌染色体或质粒中,是由处于同一操纵子的双顺反子构成,其分别编码发挥毒性作用的毒素以及具有解毒功能的抗毒素。越来越多的证据表明TA系统参与了细菌基因组稳定性、生物膜形成、噬菌体抵抗、持留菌形成以及细菌毒力等。以TA系统为靶点,以激活毒素的毒性为手段的抗生素研发策略已在多个致病菌中初见成效,并在结核分枝杆菌中表现出抑菌效果,已经成为抗结核药物研发的新策略。在结核分枝杆菌中含有至少79对TA系统,其中11对TA系统未进行生物学功能的验证。11 对 TA 中有 3 对(Rv0836c-Rv0837c、Rv1045-Rv1044、Rv2827c-Rv2826c)预测属于Ⅳ型TA。本研究选取其中一对TA系统Rv1045-Rv1044进行系统的生物学功能研究。Rv1045-Rv1044以TA系统特征性的双顺反子形式分布在结核分枝杆菌H37Rv基因组中,并通过细菌毒性和中和试验明确Rv1045-Rv1044为典型的TA,即Rv1045毒蛋白的表达能够抑制大肠杆菌的生长,而其相应的抗毒蛋白Rv1044表达能解除毒蛋白对大肠杆菌的抑制作用。体外免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)试验结果显示 Rv1045 和 Rv1044 存在相互作用,与之前推测的Rv1045与Rv1044之间无相互作用而归属于Ⅳ型TA系统结论相悖。对Rv1045毒蛋白进行结构解析,发现其编码鸟苷酰转移酶样蛋白,包括了 N端结构域(N-terminal domain,NTD)和 C 端结构域(C-termina]domain,CTD),NTD(1-181 aa)呈现出核苷酸转移酶样蛋白特有的α/β折叠。长α2螺旋被七个β-折叠(β1-β7)和五个α－螺旋(α1-α5)所环绕。CTD是由5个α螺旋组成的一个扭曲的螺旋束(α6-α10)。NTD和CTD之间形成了一个大的中央空洞,且富含正电荷,提示该空腔具有NTP结合口袋和核苷酸转移酶(nucleotidyl transferase,NTase)活性位点的功能,NTP结合试验显示Rv1045可以与GTP特异性结合,提示毒蛋白的毒性发挥可能依赖于转移GMP到靶分子(蛋白或者核酸)从而引发毒性,其具体机制需深入研究。非常有趣的是,与单独表达的Rｖ1045D82A结构相比,与抗毒蛋白共表达的Rv1045结构中,在S78位发生磷酸化修饰。为了进一步确定S78磷酸化修饰为抗毒蛋白Rv1044所为,我们又分别解析了Ｒv1045S78A、Rv1045D82A和Rv1045E146Q的单独表达的晶体结构以及和Rv1044共表达后的晶体结构。通过7个晶体结构的分析比对,我们从晶体学上确定了 S78磷酸化与Rv1044表达有关。随后,我们对单独表达和与Rv1044共表达的Rv1045及其突变体蛋白进行质谱鉴定,进一步证实了 Rv1044参与了 Rv1045晶体结构的S78磷酸化修饰。最后,通过体外激酶实验证明Rv1044直接参与了 Rv1045S78磷酸化,并通过毒性和中和实验证明Rv1045S78的磷酸化直接导致了其毒性丧失。综上所述,我们通过对结核分枝杆菌中一对TA系统Rv1045-Rv1044研究表明,Rv1045-Rv1044为一对典型的TA系统,Rv1045编码鸟苷酰转移酶样蛋白,其通过转移GMP到靶分子发挥毒性作用。而抗毒蛋白Rv1044为一种非典型性激酶,其通过一种翻译后修饰—磷酸化的方式发挥解毒功能,该解毒方式在TA系统中从未报道过。鉴于抗毒蛋白Rv1044与毒蛋白Rv1045之间存在直接的相关作用,Rv1045-Rv1044之间的解毒机制为激酶和底物的关系。因此,Rv1045-Rv1044为一种全新型的TA系统—Ⅶ型TA。其中,Rv1045为Ⅶ型鸟苷酰转移酶样蛋白(Type Ⅶ guanylyltransferase-like toxin,TglT),Rv1044 为 Ⅶ 型非典型激酶(Type Ⅶ atypical kinase antitoxin,TakA)。我们的研究结果不仅丰富了 TA系统的研究内容,并为以Rv1045-Rv1044为靶点的药物设计提供依据。