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幽门螺杆菌(Helicobacter pylroi,简称H. pylori或HP),能够引起慢性胃炎、胃溃疡等消化道相关疾病,是WHO癌症协会规定的细菌中唯一的Ⅰ类致癌因子。以质子泵抑制剂(proton pump inhibitor,PPI)结合阿莫西林和克拉霉素(或者甲硝唑)的三联疗法,是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。然而,由于克拉霉素的耐药的不断上升,这种疗法的成功率正在逐渐的下降。另一个影响这种三联用药的成功率的是人类的细胞色素P450的同工酶CYP2C19基因的多态性,其基因类型决定了PPI在人体内降解的速度。因此,在使用三联疗法治疗HP感染之前,如果能提供准确的克拉霉素药敏结果和CYP2C19基因类型,进行针对性的选择药物,能够很好的保证治疗的成功率。然而,传统的培养和药敏试验以及其它快速检测方法,并不能满足这一要求。我们设想通过real time PCR方法在一次试验中能够从胃粘膜标本中检测HP感染,评价其克拉霉素耐药情况,并提供患者CYP2C19基因类型。本研究首先对北京地区的儿童HP原发耐药情况进行了调查,并对这些菌株的克拉霉素耐药相关的HP23S RNA基因和喹诺酮耐药相关基因gyrA和gyrB进行了分析。选择北京儿童医院来源的13C尿素酶呼气试验(13C-UBT)阳性的儿童患者120例,获取胃粘膜标本进行HP分离培养,用E-test方法进行药敏试验。结果显示所分离到的73株HP对克拉霉素、阿奇霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、莫西沙星和利福平的耐药率分别为84.9%、87.7%、61.6%、13.7%、5.1%和6.8%；对阿莫西林、庆大霉素和四环素不耐药。另外,二重、三重和四重耐药率分别为46.6%(34/73)、15.1%(11/73)和2.7%(2/73)。克拉霉素耐药HP 23S RNA基因中A2142C,A2142G和A2143G的突变率分别为1.5%(1/65)、6.2%(4/65)和84.6%(55/65)。喹诺酮耐药HP的GyrA中,Asn87、Asp91和Met191的突变率为41.7%(5/12)、25%(3/12)和25%(3/12),但是Met191多为伴随突变。结果显示,北京儿童HP原发耐药率非常高,并且多重耐药现象严重,四重耐药现象在儿童来源HP中为首次报道。HP 23S rRNA基因中A2142G和A2143G突变为克拉霉素耐药主要原因。GyrA中Asn87、Asp91突变为喹诺酮耐药主要原因。本研究根据HP克拉霉素耐药相关突变的流行状况,结合幽门螺杆菌特异基因及CYP2C19等位基因,进行了多重PCR方法的构建。选择人上皮细胞中核糖核酸酶P(RNP)为内参,合成一条标记HEX的TaqMan探针:从中国CDC传染病诊断室测序的全国各地来源的74株HP的cag致病岛(cagPAI)中选择一段保守基因,作为HP检测特异基因,合成一条标记FAM的TaqMan探针：将HP 23S RNA基因的野生型、A2142G和A2143G作为HP克拉霉素耐药检测的位点,合成三条LNA-TaqMan探针,野生型标记FAM,两条突变型标记HEX；人CYP2C19第五外显子G681A和第四外显子G636A为其等位基因,分别针对这两处设计两对LNA-TaqMan探针,各自标记FAM和HEX。以上探针经过特异性验证和条件优化,然后将RNP和HP特异探针、三条HP 23S RNA基因探针、CYP2C19基因的两对探针进行组合,对组合探针进行验证和优化。所合成探针都有很好的特异性,并且组合后能够进行检测。通过以上实验成功构建了多重PCR方法,能够在一次real time PCR试验中,通过四个反应体系,实现HP感染诊断、HP克拉霉素耐药评价、CYP2C19等位基因分析三个目的。最后,运用构建好的多重real time PCR对全国十三家三甲医院来源的1791份胃粘膜标本进行了检测,这些标本来自13C-UBT阳性患者或者经快速尿素酶试验(RUT)检测阳性。将检测结果与培养和E-test药敏试验以及普通PCR方法的检测结果进行对比,评价real time PCR方法在HP感染诊断中的可行性。培养、普通PCR和real timePCR三种方法的检测结果分别为62.37%、72.47%、84.81%。E-test和real time PCR对HP克拉霉素的耐药率检测结果分别为29.50%和31.67%,两者符合率为88.88%,经一致性检验Kappa值为0.681。Real time PCR方法对HP感染的检出率明显高于培养和普通PCR的方法,其对HP克拉霉素耐药的检测结果与E-test方法高度一致。综上,本研究在分析我国HP克拉霉素耐药基因流行的基础上,结合中国CDC传染病所诊断室的前期研究结果,建立了一种多重real time PCR方法。能够在一次试验中从胃粘膜标本中检测HP感染,评价HP克拉霉素耐药,并且提供PPI的选择依据。将这种方法应用于临床标本检测,与培养和普通PCR方法进行了对比。结果显示,本方法快速、准确,对克拉霉素耐药检测与E-test方法结果高度一致。显示了多重real time PCR方法在HP感染快速诊断和耐药评价中具有较强的可行性。