米根霉(Rhizopus oryzae)是发酵制备L-乳酸等有机酸的重要菌株之一,具有发酵培养条件及工艺简单、产品乳酸的光学纯度高等优点,有较高的工业应用潜力。但米根霉存在木糖代谢速率以及五、六碳糖共发酵强度低的缺点,阻碍了其对木质纤维素生物质的高效利用。本文以米根霉AS 3.819菌株为研究对象,以增强米根霉AS 3.819五、六碳糖共代谢能力为目标,运用基因工程技术构建了米根霉的整合型表达载体以及转化筛选方法,并针对木糖还原酶进行了遗传改造。完成的主要研究工作和成果总结如下：1)米根霉木糖代谢及五、六碳糖共发酵研究。分析了木糖代谢关键酶活性受碳源底物的诱导和抑制情况。分析了米根霉木糖以及葡萄糖、木糖共发酵的状况,并比较米根霉以木糖和木糖醇作为底物的发酵状况,认为米根霉木糖代谢可能的限速酶为木糖还原酶。分析添加表面活性剂情况下米根霉的发酵状况,确认葡萄糖对木糖代谢的阻遏作用是五、六碳糖共发酵过程受限的主要原因。2)米根霉启动子片段的克隆及启动活性研究。构建了启动子探针载体pUKMR,以大肠杆菌为宿主,比较了米根霉基因启动子的功能及启动活性。通过不同碳源底物下启动子片段的启动活性比较,分析了底物对启动子的诱导作用。分析了乳酸脱氢酶基因启动子片段长度对启动活性的影响。3)以潮霉素B抗性为选择标记的米根霉遗传转化方法的建立。应用重叠延伸PCR技术构建了以潮霉素B抗性为选择标记的整合型真核表达载体,成功转化米根霉。考察了转化条件对转化率的影响,得到了较优转化条件。应用荧光定量PCR技术研究了转化子质粒整合拷贝数对抗性遗传稳定性的影响。4)米根霉木糖还原酶基因的克隆及异源表达。应用反转录PCR的方法,得到了木糖还原酶基因的cDNA片段,并利用毕赤酵母蛋白表达系统进行了异源表达,得到具有木糖还原酶活性的重组蛋白。对重组蛋白进行了分离纯化并研究了其酶学性质,及其底物和辅酶偏好性。应用定点突变技术,分析了其蛋白氨基酸位点Thr226和Val274对辅酶偏好性的影响。5)米根霉木糖还原酶基因的遗传改造。针对木糖还原酶基因对米根霉进行遗传转化,得到了多拷贝表达木糖还原酶基因的米根霉转化子,并应用组成型基因启动子启动目的基因表达,解除了葡萄糖的阻遏作用。对转化子木糖发酵以及葡萄糖、木糖共发酵情况的研究表明转化子木糖代谢能力提升,但在共发酵情况下木糖代谢依然受到的阻遏。通过表面活性剂增加细胞通透性,发现转化子在共发酵情况下能以较低速率代谢木糖。