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哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1,mammalian target of rapamycin complex 1)的激活不仅能促进蛋白质的合成,还能抑制自噬等蛋白质的降解途径的发生。氨基酸尤其是亮氨酸不仅是蛋白质合成的原料,也能作为信号分子参与mTORC1的激活过程。近年来,越来越多的蛋白被发现参与氨基酸激活mTORC1的过程。然而,关于氨基酸在细胞内的感应机制尚不明确,细胞中还可能存在其它未知的蛋白质分子参与氨基酸激活mTORC1的过程。本研究通过构建用于研究mTORC1信号通路的无细胞体系(Cell-free system),结合同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技术及生物信息学分析,初步筛选参与亮氨酸调节mTORC1信号通路的关键差异候选蛋白质。本研究的无细胞体系由溶酶体粗提物(包括P20(+)和P20(-))、胞浆蛋白(包括S100(+)和S100(-))、纯化的标签蛋白HA-raptor(mTORC1的组分之一)组成。无细胞体系结果表明,在由胞浆蛋白S100(-)和溶酶体粗提物P20(-)组成的无细胞体系中,亮氨酸能促进Raptor与溶酶体P20(-)的结合。无细胞体系反应完成后,我们将对照组的上清和沉淀(S1,P1)与亮氨酸组的上清和沉淀(S2,P2)进行iTRAQ试验。本次iTRAQ试验共鉴定到6292个蛋白,以变化倍数(Fold change)>1.2或<0.83和Q值(Q-value)<0.05两个条件进行差异蛋白的筛选。在P2-VS-P1组中,上调差异蛋白数(Up-regulated proteins)为208个,下调差异蛋白数(Down-regulated proteins)为190个;在S2-VS-S1组中,上调差异蛋白数(Up-regulated proteins)为12个,下调差异蛋白数(Down-regulated proteins)为3个。对上述差异蛋白进行生物信息学分析(包括GO、COG注释、Pathway注释分析)后发现,差异蛋白主要为细胞器上参与代谢过程的蛋白,且参与脂质代谢和与神经退行性疾病相关的蛋白也可能参与亮氨酸对mTORC1的激活过程。参与亮氨酸激活mTORC1信号通路的关键差异候选蛋白需要综合考虑上清和沉淀中的差异蛋白。其中,在上清中下调且在沉淀中上调的蛋白数为0,而在上清中上调且在沉淀中下调的蛋白有6个,因而我们初步将这6个蛋白(APOA1、CFH、FGA、ERH、CANX、F2)定义为参与亮氨酸激活m TORC1信号通路的关键差异候选蛋白。对CANX进行初步验证后发现,无细胞体系样品中该蛋白的分布规律与iTRAQ数据一致,且CANX与溶酶体上的标志性蛋白Lamp2的共定位结果也说明亮氨酸能促进CANX向细胞质中迁移。综上所述,(1)本研究首次成功构建了用于研究亮氨酸调节mTORC1信号通路的无细胞体系,且该体系有效性好,稳定性高。(2)iTRAQ数据与生物信息学分析结果表明,APOA1、CFH、FGA、ERH、CANX、F2可能参与亮氨酸对于mTORC1信号通路的调节。