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胎盘是哺乳动物母体与胎儿之间进行物质交换的器官,母体通过胎盘向胎儿转运营养物质的种类和数量对胎儿的生长发育起到至关重要的作用。葡萄糖作为动物妊娠期胎儿的主要能量来源,其转运依靠胎盘绒毛膜滋养层细胞葡萄糖转运蛋白(GLUTs)来完成。胰岛素样因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一种生长调节多肽,对动物的生长发育和生理调节有重要作用。本试验采用原代培养的方法建立SD大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞培养模型,通过研究IGF-Ⅰ对滋养层细胞增殖和葡萄糖转运蛋白表达的影响,旨在从细胞和分子水平上揭示胎盘绒毛膜滋养层细胞增殖规律及葡萄糖转运的调控机制,为研究母猪胎盘发育和葡萄糖转运及其调节机制奠定基础。
试验选用孕龄15d的SD大鼠,在无菌条件下分离其胎盘组织,通过胰酶消化法和差速贴壁法分离纯化获得了绒毛膜滋养层细胞,经免疫荧光方法及RT-PCR方法鉴定所获得的细胞为滋养层细胞。在此基础上,分别在0％血清和5％血清培养液中添加不同浓度的IGF-Ⅰ(0、0.1、1、10、50、100ng/ml),同时设正常血清组(添加20％胎牛血清),用MTT法和流式细胞术检测了IGF-Ⅰ对滋养层细胞增殖和细胞周期变化的影响。最后,应用实时荧光定量PCR方法检测了无血清培养下不同浓度IGF-Ⅰ对滋养层细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT1、GLUT3和GLUT4)mRNA表达量的影响。
研究结果如下:
1.所获得细胞经免疫荧光化学法和RT-PCR法鉴定为上皮源滋养层细胞,且纯度达95％以上,可满足后续试验要求。
2.。MTT法结果显示,与正常血清组相比,0％及5％血清IGF-Ⅰ各处理组细胞OD值在24h和48h均显著降低(P＜0.05)。0％血清IGF-Ⅰ处理组之间在24h时细胞OD值差异均不显著(P＞0.05);48h时,细胞OD值随IGF-Ⅰ浓度的增加而升高,添加10ng/mlIGF-Ⅰ能显著提高细胞OD值(P＜0.05)。5％血清IGF-Ⅰ处理组在24h和48h时,IGF-Ⅰ各处理组细胞OD值均随IGF-Ⅰ浓度增大而增大;在24h时,添加100ng/ml IGF-Ⅰ能显著提高细胞OD值(P＜0.05);在48h时,添加10ng/ml IGF-Ⅰ能显著提高细胞OD值(P＜0.05)。
3.流式细胞术结果显示:与正常血清组相比,0％血清及5％血清IGF-Ⅰ各处理组G0-G1期细胞百分比显著升高(P＜0.05),S期细胞百分比显著降低(P＜0.05),G2-M期细胞百分比无明显变化。0％血清组,添加1ng/ml IGF-Ⅰ能显著降低G0-G1期细胞百分比(P＜0.05);添加0.1 ng/ml IGF-Ⅰ能显著提高S期细胞百分比(P＜0.05)。5％血清组,添加50 ng/ml IGF-Ⅰ能显著降低G0-G1期细胞百分比(P＜0.05),添加1 ng/mlIGF-Ⅰ能显著提高S期细胞百分比(P＜0.05)。当添加50ng/ml IGF-Ⅰ培养0～4d时用流式细胞仪检测细胞周期发现,0％血清组和5％血清组中,G0-G1期细胞百分比随培养时间的延长而升高,G2-M期细胞百分比没有明显变化,S期细胞百分比随培养时间的延长迅速下降,其中0％血清组S期细胞百分比在第1d显著降低(P＜0.05),而5％血清组S期细胞百分比在第2d显著降低(P＜0.05)。
4.实时荧光定量PCR结果显示:,0ng/ml IGF-Ⅰ组GLUT1mRNA表达量与正常血清组相比差异不显著(P＞0.05),而GL凡JT3和GI上JT4mRNA表达量与正常血清组相比显著降低(P＜0.05)。不同IGF-Ⅰ处理组间相比,GLUT1表达量随IGF-Ⅰ添加剂量的增大而升高,当IGF-Ⅰ添加剂量达到50ng/ml时差异显著增大(P＜0.05);而GLUT3和GLUT4表达量随IGF-Ⅰ添加剂量的增加呈峰型变化,当IGF-Ⅰ添加量为10ng/ml时,GLUT3表达量达到最大,而当IGF-Ⅰ添加剂量为50 ng/ml时,GLUT4表达量达到最大。
5.GLUT1、GLUT3和GUJT4的mRNA表达量随时间的变化规律:在IGF-Ⅰ添加剂量为50ng/ml的情况下,不同处理时间点(0、6、24、48、72h)相比,GLUT1、GLUT3和GLUT4表达量随处理时间的延长呈先降低后升高的趋势,在24h时降到最低点。其中GLUT1的表达量在48h时显著升高(P＜0.05),GLUT3在72h时显著升高(P＜0.05),而GLUT4表达量在24h后虽然有升高,但仍低于Oh的表达水平。