沙眼衣原体Pmp蛋白的表达纯化及其临床检测的研究

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沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,C.t)是目前国内外引起性传播疾病最常见的病原体。C.t D~K型引发的泌尿生殖道感染在临床上有不同的表现形式:有的有自觉症状、有的症状隐匿;有的可以很快治愈,有的则迁延反复,还有的可导致前列腺炎、不孕不育、异位妊娠、慢性盆腔炎等多种严重并发症。C.t其他血清型可引起沙眼和性病性淋巴肉芽肿。预防和控制C.t感染已成为重要的公共卫生问题。衣原体多形外膜蛋白(polymorphic membrane proteins,Pmp)是近年来新发现的位于衣原体外膜上的一个独特的蛋白家族,推测它们可能具有黏附、分子转运、信号传导等细胞壁相关功能,并与衣原体的免疫逃逸和组织嗜性有关。已成为当今衣原体研究方面的热点之一。目前国外的一些研究机构正在开展Pmp蛋白与C.t泌尿生殖道感染的相关性研究。目的:克隆、表达、纯化沙眼衣原体E型Bout菌株Pmp蛋白,并鉴定其免疫原性。检测沙眼衣原体泌尿生殖道感染患者血清中的Pmp蛋白的抗体。初步探讨Pmp蛋白与沙眼衣原体泌尿生殖道感染的相关性。方法:C.t E型Bour菌株经细胞培养后提取染色体DNA作为模板,设计引物扩增出pmpG基因的N端片段(PmpG-N),并将PmpG-N定向克隆到原核表达载体PET30a(+)中构建重组质粒,转化到E.coli DH5α中表达重组质粒经过鉴定的重组质粒再转化至E.coli BL21中,在IPTG诱导下表达PmpG-N。通过His标签的镍离子交换层析柱纯化PmpG-N,并用Western-blot方法鉴定其免疫原性。从临床采集77例C.t泌尿生殖道感染患者和20例正常人的血清,采用Western-blot方法检测血清中的Pmp蛋白抗体,分组比较Pmp蛋白抗体的阳性率,并同临床资料进行相关性分析。结果:(1)C.t E型Bour菌株PmpG-N克隆成功,在E.coli BL21中得到表达。(2)纯化的PmpG-N,能够与PmpG特异性抗体结合,证实其具有免疫原性。(3)Pmps-Ab阳性率在C.t感染组为90.20%,阴性对照组为20%,感染组明显高于阴性对照组(p<0.05)。(4)C.t感染组9种Pmp-Ab都可在病人血清中检测到,但不同抗体的阳性率不同,PmpA~PmpI分别为61.04%、88.31%、63.63%、28.57%、63.63%、75.32%、62.34%、77.92%和70.13%;其中PmpB-Ab阳性率最高88.31%,PmpD-Ab阳性率最低28.57%,明显低于PmpB-Ab(p<0.05)。(5)持续感染组与转阴组9种Pmp-Ab阳性率均无显著性差别。(6)PmpD-Ab阳性率在女性患者为50%,男性患者为22.07%,女性明显高于男性(p<0.05);两组其他8种Pmp-Ab阳性率无显著性差别(p>0.05)。(7)青年组9种Pmps-Ab阳性率均明显高于中老年组(p<0.05)。结论:(1)C.t E型Bour菌株PmpG-N成功克隆表达,且具有免疫原性,为今后Pmp蛋白的基础和临床研究奠定了基础。(2)沙眼衣原体Pmp蛋白具有免疫原性,C.t泌尿生殖道感染的病人可产生针对Pmp蛋白的抗体。(3)不同的Pmp蛋白免疫原性有差别,推测PmpB免疫原性较强,PmpD免疫原性较弱。(4)Pmp蛋白抗体对机体的免疫保护作用不强。(5)Pmp蛋白的血清抗体存在个体差异和地区差异。(6)Pmp蛋白的血清抗体存在性别和年龄差异。(7)9种Pmp-Ab均可在病人血清中检测到,间接证明C.t的9种Pmp蛋白全部表达。
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