论文部分内容阅读
花青素是类黄酮合成途径的分支,光是影响花青素生物合成的最为重要的环境因子。茄子果实营养丰富,富含花青素。在实际生产中会遇到弱光条件下茄子果皮着色不良,造成品质下降的现象。由于传统测序技术的局限,对光调控茄子果实着色机制的研究还很缺乏。为此,本研究以光敏型茄子‘蓝山禾线茄’为研究材料,通过套袋处理结合RNA-seq和iTRAQ技术从mRNA水平和蛋白水平分析了光信号诱导下茄子的响应机制。主要研究结果如下:1)通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术鉴定了‘蓝山禾线茄’中的2种花青素组分:飞燕草素-3-[4-(顺式-香豆酰)-鼠李糖-(1→6)-吡喃葡萄糖苷]-5-吡喃葡萄糖苷、飞燕草素-3-[4-(反式-香豆酰)-鼠李糖-(1→6)-吡喃葡萄糖苷]-5-吡喃葡萄糖苷。光信号诱导下茄子果皮花青素的含量与时间的关系曲线呈现“S”型,曲线的拐点时间为5.191 d,由此确定了进行RNA-seq和iTRAQ样品的取样时间点(0 d、5 d、12 d)。2)通过分析RNA-seq数据发现,在5 d vs 0 d中有784个DEGs,GO功能富集分析将它们分为30个功能组别;KEGG Pathway分析获得43条显著性富集的通路,包括类黄酮合成通路。在12 d vs 5 d中有516个DEGs;GO功能富集分析将它们分为27个功能组别;KEGG Pathway分析获得29条显著性富集的通路,同样包括类黄酮合成通路。进一步分析发现注释为花青素合成结构基因的CHS、CHI、F3H、F3’5’H、DFR、ANS和调节基因MYB1的表达模式均为从0 d到5 d上调表达,5 d到12 d下调表达,在mRNA水平解释了光调控茄子花青素合成的可能机理。3)通过分析iTRAQ数据发现,在5 d vs 0 d中有293个DEPs;GO功能富集分析将它们分为37个功能组别;KEGG Pathway分析获得23条显著性富集的通路,与RNA-seq不同的是,DEPs没有显著富集到类黄酮合成通路。在12 d vs5 d中有228个DEPs;GO功能富集分析将它们分为34个功能组别;KEGG Pathway分析获得11条显著性富集的通路,同样DEPs没有显著富集到类黄酮合成通路。进一步分析表明在DEPs中仅发现CHI和F3H。4)将转录组与蛋白质组的数据进行关联分析,分别发现有52个(5 d vs 0 d)和39个(12 d vs 5 d)关联差异蛋白。在5 d vs 0 d的比较中,CHS、F3H、F3’5’H、DFR、ANS的蛋白表达无差异,基因表达有差异,CHI的蛋白与基因表达均有差异。在12 d vs 5 d的比较中,CHS、F3’5’H、DFR、ANS的蛋白表达无差异,基因表达有差异;CHI、F3H的蛋白与基因表达均有差异。结果表明花青素合成结构基因的蛋白表达模式与mRNA不完全一致。5)为了研究光诱导后短时mRNA表达水平的变化,采用RNA-seq的方法分析了受到光照后0 h、0.5 h、4 h和8 h的转录组信息。在0.5 h vs 0 h中有843个DEGs;GO功能富集分析将它们分为31个功能组别;KEGG Pathway分析获得30条显著性富集的通路。在4 h vs 0.5 h中有865个DEGs;GO功能富集分析将它们分为31个功能组别;KEGG Pathway分析获得28条显著性富集的通路。在8 h vs 4 h中有223个DEGs;GO功能富集分析将它们分为27个功能组别;KEGG Pathway分析获得18条显著性富集的通路。进一步分析发现注释为花青素合成结构基因的CHS、CHI、F3H、F3’5’H、DFR、ANS、调节基因MYB1以及光信号正调控因子HY5的表达模式均为从0 h到0.5 h基因表达水平变化不显著或略微上调表达,0.5 h到4 h大幅度上调表达,4 h到8 h基因表达水平变化不显著或略微下调表达,表现出明显的光诱导性。6)克隆了茄子CHS、CHI、F3H基因全长序列,结合实验室前期克隆的DFR以及NCBI中的F3’5’H和ANS,分析了这6个基因的外显子-内含子结构。qRT-PCR结果显示,它们在根、茎、叶、花、果皮和果肉中都有表达。其中CHS、CHI、F3’5’H、DFR和ANS在果皮中的表达量最高,而仅有F3H在茎中表达量最高。进一步分析发现花青素含量与CHS、CHI、F3’5’H、DFR和ANS的表达量呈显著正相关,除了F3H。套袋茄子的果皮中几乎没有检测到CHI、F3’5’H、DFR和ANS的表达量,而正常生长茄子的果皮中CHS和F3H的表达量也分别比套袋茄子果皮中的表达量高4.50倍和51.94倍。6个基因在低温下表达量都升高,其中CHS上升幅度最大。亚细胞定位显示CHS、CHI、F3H和DFR都定位在细胞质和细胞核中。转CHS、CHI、F3H和DFR的过表达拟南芥株系的茎和果荚都积累了更多的花青素。7)从茄子中克隆了两个蓝光受体基因,CRY1和CRY2,以及光信号负/正调控因子COP1/HY5。结合已被证明参与了调控茄子花青素的合成MYB1,发现CRY1在叶中的表达量最高,CRY2在根和果皮中的表达量最高,COP1在花中的表达量最高,MYB1在果皮中的表达量最高,而HY5在6种组织中的表达量没有显著差异。光能促进CRY1、CRY2、HY5和MYB1的表达,而抑制COP1的表达。在蓝光下CRY1和CRY2的转基因植株部分恢复了下胚轴长度表型,CRY2的转基因植株也恢复了开花时间,COP1的转基因植株抑制了光下的花青素积累和黑暗下的子叶张开表型,而HY5转基因植株的下胚轴恢复了与野生型相似的长度。这些结果表明这四个基因具有CRY1、CRY2、COP1和HY5的功能。酵母双杂交和双分子荧光互补实验证实,CRY1和CRY2分别能与COP1在酵母和植物中发生依赖于蓝光的相互作用。同样COP1能分别与HY5和MYB1在酵母和植物中发生相互作用。酵母单杂交实验显示,HY5和MYB1可以结合到CHS和DFR的启动子上。由此,本研究提供了一个新的描述光诱导茄子花青素合成的调控通路:在光下,光受体蛋白CRY1和CRY2接受光信号后与COP1结合,使下游转录因子HY5和MYB1得到了积累,从而与CHS和DFR的启动子结合促进它们的表达,最后合成花青素使茄子果实着色;在黑暗下,CRY1和CRY2不能与COP1结合,COP1就与HY5和MYB1结合降解了它们,从而下游花青素合成结构基因不能激活表达,也就没有花青素的合成。