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番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)属于番茄斑萎病毒属的一个新种,寄主范围广泛,可侵染34个科的166种的植物,植株感染后严重阻碍植物生长,影响品质和降低产量,尤其在云南,对当地番茄、辣椒的生产造成严重危害。目前的检测方法多需要专门仪器和专业操作人员,难以满足现场快速大量检测,因此建立简单、高效、快速的检测方法对植物病害的诊断、病害流行规律的分析、预测预报和病害防治等方面具有重要意义。本研究根据田间快速检测需求的现实情况,成功制备出了番茄环纹斑点病毒的单克隆抗体,并以单抗和免疫层析技术为核心,建立了胶体金金免疫层析试纸条检测方法,该方法具操作简单、反应时间短、特异性强、灵敏度高等特点。通过原核表达番茄环纹斑点病毒的核衣壳蛋白,纯化透析去离子后,用作免疫小鼠的抗原,经三次免疫后,检测效价,对效价值最高的小鼠进行加强免疫。采用杂交瘤技术,将冲击免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞在PEG1500作用下融合,对初次筛选到的阳性克隆进行2～3次亚克隆筛选,获得了三株可稳定分泌抗TZSV-N蛋白的细胞株,命名为3A2、5D2、5F7,抗体亚型都为重链IgM,轻链K链。小鼠体内诱生腹水后,对腹水抗体进行效价检测、dot-ELISA和Western Blot分析,结果表明3A2、5D2、5F7的效价分别可达128000、64000、64000,在dot-ELISA分析中,三株都可特异性识别番茄环纹斑点病毒,且不与包括同属病毒番茄斑萎病毒等发生反应。Western Blot分析中,三株单抗都可与番茄环纹斑点病毒产生特异性条带。本研究进一步采用优球蛋白沉淀法纯化单克隆抗体并使用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金溶液用以标记单克隆抗体。通过单克隆抗体配对实验,选择3A2作为金标抗体,5D2作为检测线上包被抗体,用于后续的实验。本实验最终选择PH值7.5的胶体金溶液标记150ug/ml的纯化后抗体3A2。采用sigma公司羊抗鼠IgG稀释10倍后,包被于硝酸纤维素膜(NC膜)的质控线上,优化金标抗体浓度、离子浓度等反应条件,组装成试纸条,用于试纸条的特异性与灵敏度分析。结果表明:制备的试纸条在5～10min之内,即可特异性识别番茄环纹斑点病毒,与黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、凤仙花坏死斑点病毒(Impaliens necrotic spot virus,INSV)五种病毒无交叉反应,灵敏度也达到田间检测的要求,对预防番茄环纹斑点病毒的传播等方面有着潜在的应用前景。