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头颈部恶性肿瘤发病率在人恶性肿瘤发病普中排第六位,尤其以鳞状细胞癌多见。HNSCC患者发生局部的侵袭与转移后,通常面临不良的预后,生存率明显降低。因此,寻找调节头颈部鳞癌患者发生侵袭与转移的分子靶点,并阐明其发挥作用的具体机制,对于提高头颈部鳞癌患者的预后具有十分重要的意义。研究发现锌离子对肿瘤的侵袭性和转移具有重要意义,因为它可以改变紧密连接蛋白并选择性地增强上皮屏障。ZIP4是锌铁调控蛋白(ZRT,IRT-like protein,ZIP)家族的一员,ZIP家族是一类金属离子转运体,其主要功能与锌转运体(zinc transporter,Zn T)家族共同发挥作用,维持细胞内Zn 2+保持在稳定状态,ZIP主要是将是将锌离子转入细胞内,其中,ZIP4由SLC39A4基因编码,通过将膳食锌摄入细胞并从细胞溶质囊泡室中释放锌,在维持细胞锌浓度方面发挥重要作用。有研究发现ZIP4在淋巴瘤、恶性黑色素瘤、转移性结肠癌等多种恶性肿瘤中表达升高,且与肿瘤的恶性程度、临床分期等相关.因此,我们想阐明ZIP4是否在HNSCC中的发挥作用及其具体机制,为寻找头颈部鳞癌潜在的治疗靶点提供实验依据。方法第一部分:验证HNSCC肿瘤细胞中ZIP4的表达特征,主要通过以下实验:主要通过以下实验:(1)通过IHC实验方法鉴定ZIP4的表达强度与临床病理分期之间的关系;(2)q RT-PCR检测癌旁与癌组织中ZIP4的表达水平;(3)通过WB研究ZIP4蛋白表达水平与病人预后之间的关系。第二部分:以头颈部鳞癌细胞系Fadu为研究对象,分别:(1)使用不同浓度ZNCL2以及锌离子螯合剂TPEN处理细胞,Western blot检测不同浓度Zn 2+剂量下ZIP4表达变化以及EMT相关蛋白表达变化;(2)transwell实验、划痕实验验证细胞侵袭和迁移能力的改变(3)构建ZIP4过表达稳定细胞系,验证细胞形态与行为变化○4 Western blot检测不同ZIP4表达状态下EMT相关蛋白表达变化○5 transwell实验、划痕实验验证细胞侵袭和迁移能力的改变;○6免疫荧光法:F-actin染色检测细胞骨架的结构变化并且进一步了解肿瘤细胞侵袭伪足的变化。第三部分:使用感染Luciferase慢病毒的头颈部鳞癌细胞系FADU、FaduZIP4,通过观察荧光强度以藕建立小鼠脚掌转移模型。通过小动物活体成像系统像检测肿瘤的生长及转移情况。在体内环境下了解ZIP4对HNSCC侵袭和转移的影响。结果IHC显示,ZIP4在肿瘤侵袭前缘和浸润于脂肪组织中的肿瘤细胞表达明显高于分化良好的HNSCC。ZIP4高表达的HNSCC肿瘤细胞多呈现梭形、细胞核深染,与SCC角化珠内的肿瘤细胞形态完全不同,具有典型的间质细胞的特征。q RT-PCR检测发现癌组织中的ZIP4 m RNA表达水平高于癌旁组织,并且转移灶表达水平高于原发灶。之后通过WB检测发现,ZIP4低表达的患者较ZIP4高表达的患者预后较好。使用不同浓度的ZNCL2处理Fadu细胞,ZNCL2浓度较低时,E-cadherin等表达升高,N-cadherin等表达下降,ZIP4蛋白表达水平下降,高浓度ZNCL2处理细胞时,E-cadherin等表达下降,N-cadherin等表达升高,ZIP4蛋白表达水平升高,使用锌离子螯合剂TPEN处理后,高锌引起的蛋白水平的变化被逆转。细胞划痕和Transwell侵袭实验表明,低锌环境下,细胞迁移和侵袭能力下降,高锌环境下,细胞迁移和侵袭能力升高。通过构建ZIP4高表达与敲低稳系,Western blot实验发现细胞侵袭及转移能力与ZIP4的表达水平呈正相关。Transwell侵袭实验及迁移实验和划痕实验证明,ZIP4表达升高细胞的侵袭和迁移能力显著增加,敲低ZIP4细胞侵袭和迁移能力显著下降。细胞免疫荧光实验表明ZIP4表达升高侵袭伪足增加,细胞侵袭能力增强。HNSCC脚掌转移动物模型结果提示:ZIP4高表达组细胞转移能力高于对照组(P<0.05)。小鼠处死后股骨剥离解剖发现,ZIP4高表达组,细肿瘤转移至股骨远端,细胞转移能力明显高于对照组。结论1.HNSCC侵袭前缘的肿瘤细胞中ZIP4表达升高;2.ZIP4表达水平与肿瘤患者的预后具有明显的相关性;3.锌离子浓度影响HNSCC细胞的迁移侵袭能力;4.ZIP4的表达水平随着锌离子的变化而变化;5.ZIP4过表达增强HNSCC细胞的侵袭能力和迁移能力;6.体内环境下,ZIP4表达升高,细胞的转移能力增强;