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本研究应用分子生物学手段从产生不同捕食器官的捕食线虫真菌代表物种及不产生捕食器官的Dactylella属真菌代表物种中分别克隆得到了与过氧化物酶体形成相关的基因(分别是寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora中AOL_S00007g540、AOL_S00054g525、AOL_s00215g40、AOL_S00054g410的同源基因)以及粘性物质形成相关基因(寡孢节丛孢A.oligospora中AOL_S00076g567的同源基因),并通过系统发育分析在分子水平上对过氧化物酶体相关基因及粘性物质相关基因进行分析,探讨捕食线虫真菌不同捕食器官类型的进化。 1、分别基于四个过氧化物酶体基因构建的系统发育树存在捕食器官聚类的差异,可能由于不同的基因在过氧化物酶体形成过程中所扮演的角色各不相同,并且在不同捕食器官形成过程中发挥的作用也不尽相同导致。合并从19株产生不同捕食器官的捕食线虫真菌中选取的三个过氧化物酶体基因AOL_S0054g410、AOL_S00007g540和AOL_S00215g40后,得到624个氨基酸位点进行系统发育分析,显示捕食线虫真菌按照捕食器官的类型进行聚类,并形成两个姊妹分支,产生三维菌网的真菌与产生粘性分支的真菌显示出较近的亲缘关系,提示三维菌网可能由粘性分支进化而来;在另一分支中,产生粘球及非收缩环的真菌最先分歧,紧接着是产生收缩环的真菌,再接着是产生粘球的真菌,由此提示产生粘球和收缩环可能都由产生粘球及非收缩环的真菌进化而来。 2、基于38株捕食线虫真菌的AOL_s00076g567的同源基因的系统进化分析与基于三个过氧化物酶体基因的系统进化分析结果相类似,同样显示捕食线虫真菌按照捕食器官的类型进行聚类,并形成两个姊妹分支,产生三维菌网的真菌与产生粘性分支的真菌显示出较近的亲缘关系,提示三维菌网可能由粘性分支进化而来;在另一分支中,产生粘球及非收缩环的真菌最先分歧,紧接着是产生粘球的真菌,再接着是产生收缩环的真菌。据此,我们推测,产生粘球和收缩环的真菌是由于产生粘球及非收缩环的真菌演化而来,由于非收缩环的捕食效率极低,为节省耗能,一些产生粘球和非收缩环的真菌逐渐将非收缩环也抛弃,从而形成了只产生粘球的捕食线虫真菌。而另一些则由非收缩环进化形成了更具捕捉效率的收缩环。 3、本研究基于过氧化物酶体形成相关基因以及粘性物质形成相关基因进行的系统进化分析结果与Li等人和Yang等人基于看家基因所得到的结果不尽相同。说明基于捕食器官形成相关基因的系统进化分析能为理解捕食器官的进化提供一条新的思路,但由于目前所获得的捕食器官形成相关基因数据较少。因此,从更多的捕食线虫真菌中获得更多的捕食器官形成相关基因将对理解捕食器官的进化具有积极意义。 此外,本研究还以刀孢轮枝菌(Lecanicillium psalliotae)为出发菌株,成功将蝎子毒基因T1通过原生质体转化技术转入到出发菌株中,明显提高了野生型刀孢轮枝菌的杀线虫活性,为高效线虫生防工程菌株的构建奠定了良好的基础。发酵液的胞外酶活测试结果表明第六天的酶活性最高。发酵液粗酶杀线虫活性测试结果表明到36小时工程菌较野生菌株提高了11%;水琼脂平板测试法表明到36小时工程菌的杀线虫活性比野生型菌株提高了24%。 本论文的创新性主要体现在以下方面: 1)从与捕食器官形成相关基因着手进行捕食器官的进化分析,提出了不同于以往基于看家基因分析提出的捕食器官进化假说。 2)成功地将蝎子毒蛋白T1转入到刀孢轮枝菌中,并提高了刀孢轮枝菌的杀线虫活性。首次将外源的动物毒性基因转入食线虫微生物中所构建的工程菌株杀线虫活性有了明显提高,为高效线虫生防工程菌株的构建奠定了良好的基础。