目的：　　本课题采用动物实验方法观察龟鹿二仙胶对去卵巢大鼠骨代谢指标、力学性能和骨显微结构的影响，进一步通过细胞实验观察其对rBMSCs增殖和成骨分化的作用并探讨其作用机制，希望为临床应用龟鹿二仙胶防治绝经后骨质疏松症提供实验依据，从微观角度为“肾主骨”理论提供实验支持。　　方法：　　1、去卵巢大鼠骨代谢、力学性能及骨显微结构的改变及龟鹿二仙胶的干预作用　　选用3月龄SD大鼠72只随机分假手术组、模型组、实验组（龟鹿二仙胶高、中、低剂量组）和对照组（雷奈酸锶组），每组各12只，除假手术组外其余各组均切除卵巢造模，造模后实验组予以龟鹿二仙胶高、中、低剂量干预，对照组予以雷奈酸锶干预，术后第12周取材。采用Elisa法检测大鼠血清E2、 BALP、OC、TRACP-5b和尿DPD浓度，DEXA法测大鼠腰椎和股骨BMD，骨形态计量学方法分析大鼠腰椎、股骨髁部骨显微结构的变化，腰椎压缩和股骨三点弯曲方法检测腰椎和股骨最大载荷，观察龟鹿二仙胶对去卵巢大鼠骨代谢、骨显微结构和骨骼力学性能的影响。　　2、龟鹿二仙胶含药血清对rBMSCs增殖、成骨分化的影响　　采用血清药理学方法制备大鼠龟鹿二仙胶（用药及剂量同实验第一部分）含药血清。全骨髓贴壁法分离rBMSCs，传代培养至F3代并通过形态观察、MTT法绘制生长曲线和FCM法检测细胞表面标记物（CD45和CD90）鉴定。以F3代细胞为实验对象，分别用浓度为10％含药血清（高、中、低剂量组）、20％含药血清（高、中、低剂量组）、10％ FBS、10％和20％空白组血清干预，MTT法检测细胞活性，FACS法检测细胞周期方法观察龟鹿二仙胶含药血清对rBMSCs增殖的影响，并确定促rBMSCs增殖含药血清的最佳干预浓度。采用确定的最佳干预浓度的含药血清干预F3代细胞，并用经典成骨诱导剂、10％FBS和10％空白血清为对照，分别于干预7、14和21d后，用ALP比活性检测龟鹿二仙胶含药血清对ALP活性的影响。干预21d后茜素红(ARS)染色和RT-PCR方法检测rBMSCs种ALP、OC mRNA的表达。　　3、龟鹿二仙胶含药血清对Wnt/β-catenin信号通路的影响　　用10％浓度的龟鹿二仙胶中剂量组含药血清干预F3代rBMSCs21d后，分别用RT-PCR和Western-Blot方法检测Wnt/β-catenin信号通路相关因子Wnt5a、Fzd-2、 Axin-2、β-catenin、Lef-1 mRNA和蛋白的表达。　　结果：　　1.去卵巢大鼠骨代谢、力学性能及骨显微结构的改变及龟鹿二仙胶的干预作用切除卵巢后，与假手术组相比，大鼠血清E2、BALP均显著降低，血清OC和TRACP-5b尿DPD浓度均升高;腰椎及股骨BMD、最大载荷均显著降低;腰椎和股骨Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均显著低于假手术组，TB.Sp则显著高于假手术组，骨骼呈骨质疏松改变。　　12周后，龟鹿二仙胶各剂量组和雷奈酸锶组血清E2水平均显著高于模型组，但不同剂量作用存在差异，高、低剂量组显著高于中剂量组和假手术组。龟鹿二仙胶中、高剂量组和雷奈酸锶组OC和BALP水平显著高于模型组，低、中剂量组BALP高于高剂量组。龟鹿二仙胶低剂量组血清TRACP-5b水平显著降低，低、中剂量组尿DPD水平显著降低，低于其余各组。龟鹿二仙胶中、高剂量组骨密度较模型组增高，但低于假手术组和雷奈酸锶组。龟鹿二仙胶各剂量组腰椎和股骨最大载荷增高，对股骨最大载荷的作用各剂量组间差异不明显，但中剂量组对腰椎最大载荷增高作用最显著。与模型组比较，龟鹿二仙胶各剂量组腰椎和股骨髁部Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N显著增高，Tb.Sp显著降低，以中剂量作用最显著。　　2.龟鹿二仙胶含药血清对rBMSCs增殖和成骨分化的影响　　F3代rBMSCs呈均匀一致的长梭形，典型旋涡状生长;MTT法绘制生长曲线，FCM法检测F3代细胞CD45阳性表达率为1.46±0.23％，CD90阳性表达率为96.97±3.21％，符合BMSCs特征。MTT法和FACS检测结果显示龟鹿二仙胶含药血清能明显促进F3代rBMSCs增殖，最佳干预条件是为10％浓度的龟鹿二仙胶中剂量组含药血清。　　以10％浓度的龟鹿二仙胶中剂量组含药血清干预F3代细胞，第7d、14d和21d龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导成骨组ALP比活性显著高于胎牛血清组和空白血清组，且该两组细胞ALP比活性随培养天数增加升高更显著，呈时间相关性，但两组间ALP比活性无显著性差异。21d时茜素红染色可见龟鹿二仙胶含药血清组和经典诱导成骨组中rBMSCs橘红色钙结节生成，RT-PCR结果显示该两组rBMSCs的ALP和OCmRNA表达均显著增高。　　3.龟鹿二仙胶含药血清对Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA和蛋白表达的影响　　RT-PCR结果显示龟鹿二仙胶含药血清组rBMSCs中Wnt5a、Fzd-2、β-catenin和VIILef-1 mRNA均显著高于空白血清组和胎牛血清组，Axin-2 mRNA表达显著低于其余各组。经典成骨诱导组Wnt5a和β-catenin mRNA表达显著高于胎牛血清组和空白血清组，与龟鹿二仙胶含药血清组无显著性差异;Fzd-2和Lef-1 mRNA表达与胎牛血清组和空白血清组无显著性差异，显著低于龟鹿二仙胶含药血清组;Axin-2 mRNA的表达与胎牛血清组和空白血清组无显著性差异，但显著高于龟鹿二仙胶含药血清组。　　Western-Blot结果显示龟鹿二仙胶含药血清组rBMSCs中Wnt5a、Fzd-2、β-catenin和Lef-1蛋白表达均显著高于空白血清组和胎牛血清组，Axin-2蛋白表达显著低于其余各组。经典成骨诱导组Wnt5a和β-catenin蛋白表达显著高于胎牛血清组和空白血清组，与龟鹿二仙胶含药血清组无显著性差异;Fzd-2蛋白表达与胎牛血清组和空白血清组无显著性差异，显著低于龟鹿二仙胶含药血清组;Axin-2蛋白表达显著低于胎牛血清组和空白血清组，但显著高于龟鹿二仙胶含药血清组;Lef-1蛋白表达显著高于胎牛血清组和空白血清组，但显著低于龟鹿二仙胶含药血清组。　　结论：　　1.龟鹿二仙胶对去卵巢大鼠骨骼具有促进骨生成和抑制骨吸收的双重作用，既增加骨密度，又同时增加骨小梁面积、宽度和节点数，明显改善骨显微结构，最终增强去卵巢大鼠骨强度。　　2.10％浓度的龟鹿二仙胶中剂量组含药血清能促进rBMSCs增殖，能通过增强Wnt/β-catenin信号通路相关因子wnt5a、β-catenin、Fzd-2、Lef-1活性，并抑制Axin-2活性，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进rBMSCs向成骨细胞分化，增加骨形成。