一、研究背景宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率仅次于乳腺癌,位居全球第二。超过85%的患者位于发展中国家,是严重危害女性身体健康的一种恶性肿瘤,其致死性的主要原因是肿瘤的治疗失败、复发及转移。发生转移的第一步是局限性的侵袭,这需要原发肿瘤发生许多表型的改变,其中恶性肿瘤的上皮细胞向间质细胞转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是引起肿瘤发生远处转移的关键步骤之一。正常上皮组织的多层细胞结构不利于恶性肿瘤细胞的运动和侵袭,为了获得运动和侵袭能力,肿瘤细胞必须丢失许多的上皮细胞的表型,使上皮层能够发生EMT。发生EMT的细胞,一方面失去了上皮细胞的典型形态,上皮细胞之间的相互作用消失,组织结构也相对松散,立方上皮细胞转变为纺锤形纤维细胞的形态,并且表现出侵袭性；另一方面,细胞的基因表达谱也发生改变,上皮细胞的标志性蛋白如E-cadherin表达下调,而间质细胞的标志蛋白如N-cadherin表达上调。恶性实体肿瘤中央的细胞为上皮细胞的表型,周围细胞常常会呈现间质细胞表型,因此周围细胞往往具有较强的运动能力而促使肿瘤细胞在局部产生浸润,并且侵入到血管和淋巴管进而转移至远处靶器官,随后恶性肿瘤的细胞可以发生间质细胞向上皮细胞转化(mesenchyma1—pithelial transitions, MET)来重建细胞之间的连接以及细胞骨架,从而形成转移灶。因此EMT是一个多步骤的动态的可逆的变化过程。microRNA (miRNA)是广泛存在于真核生物中的非编码的小分子RNA。miRNA具有明显的结构特征,即成熟的miRNA通常是由长度为20-25个核苷酸的单链结构组成,其5’端有一个磷酸基团,3’端为羟基。miRNA与其靶基因的mRNA的3’非编码区相结合,能够通过抑制靶基因mRNA翻译和促进mRNA的降解而抑制靶基因的表达。由于miRNA与靶基因的结合并不是完全互补的,因此,同一个miRNA可以有多个不同的靶点。而在同一个miRNA中有两条部分互补的双链,根据miRNA在其前体pre-miRNA上的位置分别命名为5p和3p,这两条链可以结合在不同的mRNA上,各自行使不同的功能。目前,一系列的研究证据表明,miRNA与肿瘤的发生发展密切相关,能够影响细胞的增殖、侵袭和迁移以及EMT。目前所发现的与肿瘤相关的miRNA,一部分能够促进肿瘤的发生发展,具有促进恶性肿瘤的作用,而另一些则能够抑制肿瘤的发生发展,发挥抑制恶性肿瘤的作用。随着研究的逐步深入,将会有更多的与肿瘤相关的miRNA被发现。microRNA在肿瘤中的表达常常是失调的,其表达特征不仅具有组织特异性,而且在肿瘤发生的不同阶段也各有差异,分析肿瘤的组织特异的microRNA的表达谱可应用于肿瘤的早期诊断并且能够指导治疗。因此,microRNA的研究对于宫颈癌的诊断、治疗以及预后估计也具有重要意义。人类SFMBT1是一种PcG蛋白,也属于MBT (malignant brain tumor)蛋白家族,在维持转录沉默方面具有重要作用。研究表明SFMBT1可间接促进HSC/前体细胞活性,在维持造血干细胞的干性特征方面发挥重要作用。SFMBT1调节MyoD介导的转录沉默从而稳定肌源性前体细胞的未分化状态,并能够促进细胞增殖。SFMBT1参与Snail诱导的转录抑制,从而抑制细胞的上皮性特征,诱导乳腺癌上皮向间质转化。SFMBT1是TGF-p抑制肺癌上皮基因表达促进其发生EMT的过程中必不可少的因素。LSD1-SFMBT1-Snail诱导的染色质调节程序能够诱导癌细胞发生EMT并促进癌症的进展和转移。总之,SFMBT1通过其转录抑制作用,在维持细胞干性、促进细胞增殖、促进癌症细胞EMT及侵袭性方面有重要作用,能够促进细胞进展和转移,与肿瘤不良预后相关。我们的研究发现SFMBT1是miR-218的直接靶点,miR-218能够通过抑制SFMBT1的表达而抑制宫颈癌细胞的EMT和侵袭迁移。我们首次发现下调SFMBT1能够抑制宫颈癌细胞发生EMT,与过表达miR-218的作用相似。而过表达SFMBT1能够逆转miR-218抑制肿瘤细胞侵袭和迁移能力,也能够逆转miR-218抑制EMT的作用。这些研究结果提示,下调SFMBT1在miR-218抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力及抑制EMT的发生的过程中发挥关键作用。SCCRO/DCUN1D1/DCN1是一种致癌基因。研究表明,超过50%的头颈癌、70%肺鳞癌、55%卵巢囊腺癌、34%宫颈癌和内膜癌、26%肺腺癌、15%恶性胶质瘤存在DCUN1D1的过表达。DCUN1D1与肺癌的T分期、肿瘤分期相关,其过表达能促进肺鳞癌的局部淋巴结转移和脑转移,降低肺鳞癌患者的生存期；可以增强细支气管肺泡癌细胞的局部侵袭；能够参与胶质瘤的形成,促进恶性胶质瘤的进展。此外,DCUN1D1的表达与血管内皮生长因子-α(VEGF-α)表达相关,能够促进血管生成。过量饮酒或吸烟能够引起染色质的异常,增强DCUN1D1的表达,而促进头颈鳞癌、肺癌等癌症的发生发展。在本研究中,我们发现在宫颈癌细胞中DCUN1D1是miR-218的靶基因,受到miR-218下调。干扰DCUN1D1能够抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移,而过表达DCUN1D1能够逆转miR-218对宫颈癌细胞侵袭和迁移的调节。这些结果提示,DCUN1D1的下调在miR-218抑制肿瘤细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用。越来越多的研究发现miR-218在多种肿瘤中异常表达。miR-218在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、膀胱癌和宫颈癌等恶性肿瘤中均表达量降低,且在转移肿瘤的表达低于良性肿瘤。在上述肿瘤miR-218低表达与侵袭迁移及不良预后密切相关。这些研究说明miR-218在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色。虽然这些研究将miR-218与肿瘤转移联系在一起,但miR-218的具体功能以及相应的机制尚不明确,需要进一步研究。本研究旨在探究miR-218对宫颈癌转移的作用及其机制。二、研究方法1细胞培养与处理SiHa、HeLa细胞使用高糖DMEM,分别添加10%胎牛血清,在37℃、CO2的浓度为5%,相对湿度为50%细胞培养箱内培养,根据细胞的生长速度适时更换培养基,用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA工作液消化分散细胞,进行传代或接种培养。2侵袭迁移试验选择生长状态良好的细胞传代至24或12孔培养板,正常过夜培养,待细胞处于对数生长期,细胞融合密度达80%左右时,采用invitorgen公司lipofactemin 2000转染试剂进行转染,具体操作参考说明书,转染48小时后,进行侵袭和迁移的检测或提取细胞的总蛋白等。迁移试验时用无血清培养基重悬1.0×105细胞接种于BD小室内；侵袭试验时用无血清培养基重悬2.0×105细胞接种于Matrigel包被的BD小室内。37℃培养箱中,培养24h后取出小室,用PBS轻轻漂洗,用95%甲醇室温固定20min;0.25%结晶紫(甲醇配制)染色,室温染色30min,清水漂净,用棉签擦去上室内细胞；镜下拍照计数。3免疫印迹试验冰上裂解细胞提取总蛋白；SDS-PAGE电泳分离蛋白并转移PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭1小时；4℃孵育一抗过夜；常温孵育二抗1小时；化学发光法胶片曝光,扫描。4荧光素酶试验充分裂解细胞,取样品50μl,加入50微升荧光素酶或p-半乳糖苷酶检测试剂,用枪打匀混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。混合后,在37℃放置30分钟或直至样品孔内出现浅黄色。加入150微升反应终止液终止反应,按仪器操作说明书开启酶标仪或分光光度计,将测定波长设定为420rnm,测定吸光度。5荧光定量PCR应用上海吉玛制药技术有限公司(Shanghai GenePharma Co.,Ltd)的Ezol提取宫颈癌细胞总RNA；分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度,进行质量控制检测；采用提供的上海吉玛制药技术有限公司的Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit检测试剂盒对miR-218进行实时定量,U6作为本实验的内参。具体实验流程参照Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit实时定量PCR检测试剂盒说明。6原位杂交和免疫组化组织芯片原位杂交：脱蜡和水化；0.2N HC1室温处理；蛋白酶K (40μg/ml)室温孵育20分钟；4%多聚甲醛固定10分钟；预处理液室温孵育10分钟；53℃杂交；室温封闭；抗地高辛一抗(1：1000)4℃孵育过夜；BCIP/NBT暗处染色；水洗残液,脱水、封片。组织芯片免疫组化：常规脱蜡水合；加热；冷却至室温；3%H202室温处理10min;山羊血清室温封闭；一抗4℃过夜；二抗室温孵育；DAB显色；苏木素复染；1%盐酸酒精分化;水洗反蓝；晾干封片。7统计学处理所有数据以平均值±标准差(mean±SD)表示,应用SPSS13.0统计软件进行数据的统计学分析。两组之间的差异比较用独立样本的t检验(Independent-samples t test),三组及以上的差异比较应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。若方差齐,直接用F检验,并用LSD检验及进行多重比较。若方差不齐,则采用校正的F检验(Welch法),并用Tamhane’s T2检验进行方差不齐条件下的多重比较。microRNA和靶蛋白的表达与宫颈癌临床病理特征的关系应用χ2检验和Fisher确切概率法。靶蛋白与microRNA的表达关系比较应用双变量相关分析。p<0.05表明差异具有统计学意义。三、研究结果1 miR-218在宫颈癌组织中低表达并且能够抑制宫颈癌细胞的EMT及侵袭迁移(1) miR-218在宫颈癌组织中的表达低于正常宫颈组织,并与肿瘤分期负相关为了进一步研究在miR-218与宫颈癌转移的关系,我们应用组织芯片分析了miR-218与宫颈癌病理参数的关系。含有104例福尔马林固定石蜡包埋的宫颈癌及癌旁正常宫颈组织的组织芯片的原位杂交结果显示,miR-218在宫颈癌组织中的表达低于正常宫颈组织,在发生了淋巴结转移的组织中的表达低于未发生转移的宫颈癌组织。这一结果说明miR-218与宫颈癌的进展及临床分期呈负相关。(2)miR-218抑制宫颈癌细胞发生EMT。为了研究miR-218对宫颈癌细胞的影响,我们在宫颈癌细胞SiHa和HeLa分别转染miR-218的mimics和miR-218的抑制剂,结果显示转染miR-218的mimics,增强miR-218的表达后能够抑制宫颈癌细胞发生EMT。首先我们转染SiHa细胞,48h后观察细胞形态。结果发现与对照组的SiHa细胞短圆相比,转染miR-218的抑制剂的细胞形态变得瘦长,呈梭形,由上皮样向间质样转化。此外,细胞骨架F-actin从杂乱分布转变为束状分布。细胞的这些变化提示,抑制miR-218的表达可能促进了细胞发生EMT。反过来,与对照组的SiHa细胞相比,转染miR-218的mimics的细胞形态相对更短圆,细胞继续保持上皮样特征,细胞骨架F-actin仍是杂乱分布。细胞的这些变化提示,miR-218可能抑制了细胞发生EMT。为了进一步确认细胞发生了EMT,我们检测了EMT相关蛋白在转染miR-218的mimics和miR-218的抑制剂后的SiHa细胞和HeLa细胞的中的变化,结果显示与对照相比,抑制miR-218表达的宫颈癌细胞的间质细胞标志分子N-cadherin表达升高,而上皮细胞标志分子E-cadherin表达下降,而增强miR-218表达的宫颈癌细胞的间质细胞标志分子N-cadherin表达下降,而上皮细胞标志分子E-cadherin表达升高,这一变化符合EMT蛋白的变化特征。上述结果说明miR-218能够抑制宫颈癌细胞发生EMT。(3)miR-218抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。为了进一步验证miR-218对宫颈癌细胞运动能力的影响,我们检测了miR-218对宫颈癌细胞侵袭和迁移能力的影响。结果显示,转染miR-218的mimics能够显著抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力,而转染miR-218的抑制剂能够增强宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。这一结果说明miR-218能够显著下调宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。2 miR-218抑制宫颈癌EMT及侵袭迁移的机制(1) SFMBT1和DCUN1DI是miR-218的靶点寻找miRNA的下游靶基因,是研究miRNA作用机制的关键。我们结合生物信息学策略筛选miR-218的潜在靶点。首先,分别应用TargetScan、PicTar、 miRanda靶基因预测软件筛选靶基因。结合miR-218的功能,我们筛选到8个抑制肿瘤转移的基因,分别是HAPLN1、SFMBT1、RNF38、UGT8、ARID4B、 BCAT1、CTNND2 和 DCUN1D1。为了验证这些基因是否是miR-218的直接靶点,我们进行了荧光素酶报告基因实验。结果显示含有SFMBT1和DCUNID1野生型3’端非编码区的报告基因载体的荧光素酶活性有显著的下降,而其它靶基因没有显著下降。这一结果初步显示SFMBT1和DCUNIDI是miR-218的直接靶点。然后,我们将含有SFMBT1和DCUN1D1突变型3’端非编码区的报告基因载体进行荧光素酶活性检测,结果显示转染miR-218的mimic与其阴性对照相比,荧光素酶活性没有显著变化。免疫印迹的结果显示,转染miR-218后,SFMBT1和DCUN1D1的表达量下调。此外,下调miR-218后,SFMBT1和DCUNID1的表达量上升。免疫印迹的结果和荧光素酶报告基因实验的结果都说明SFMBT1和DCUN1D1是miR-218的靶基因。(2)miR-218通过抑制SFMBT1和DCUN1D1的表达而抑制宫颈癌细胞侵袭与迁移能力。为了明确miR-218的功能靶基因,我们分别应用特异性的小干扰RNA和过表达质粒下调或上调宫颈癌细胞SFMBT1和DCUN1D1的表达,应用Transwell实验检测了SFMBT1和DCUNID1对宫颈癌细胞细胞侵袭迁移能力的影响。结果显示,过表达SFMBT1或DCUN1D1后,宫颈癌细胞SiHa的侵袭能力增强。干扰SFMBT1或DCUN1D1后,宫颈癌细胞SiHa的侵袭能力下降。此外,过表达SFMBT1或DCUN1D1均能够逆转miR-218对宫颈癌细胞SiHa细胞侵袭能力的影响。上述研究表明,miR-218通过抑制SFMBT1或DCUN1D1的表达而抑制宫颈癌细胞侵袭与迁移能力。(3)miR-218通过抑制SFMBT1抑制宫颈癌细胞发生EMT。过表达SFMBT1后SiHa细胞的形态变得瘦长,呈梭形,这与干扰miR-218的作用一致。而过表达DCUN1D1后,SiHa细胞形态没有明显变化。此外,过表达SFMBT1能够逆转miR-218对SiHa细胞形态的改变。免疫印迹的结果显示,与转染miR-218抑制剂类似,过表达SFMBT1后SiHa细胞的间质细胞标志分子N-cadherin表达升高,而上皮细胞标志分子E-cadherin表达下降。反过来,干扰SFMBT1后SiHa细胞的间质细胞标志分子N-cadherin表达降低,而上皮细胞标志分子E-cadherin表达升高。这样,我们首次发现下调SFMBT1能够抑制宫颈癌EMT。综上,SFMBT1可能是miR-218抑制肿瘤转移的关键分子。(4)miR-218抑制宫颈癌的EMT和侵袭能力受到HPV16 E6的调控为了明确HPV对miR-218的表达及其功能影响,我们检测了不同HPV状态的宫颈癌细胞中miR-218的表达情况,证实HPV16 E6在宫颈癌细胞中直接抑制miR-218的表达。我们通过抑制HPV16 E6发现了其在宫颈癌的EMT和侵袭能力两个方面的作用,结果表明抑制HPV16 E6可以抑制宫颈癌的EMT和侵袭能力和miR-218功能靶蛋白的表达,而抑制miR-218可以逆转抑制HPV16 E6对miR-218靶蛋白的影响,因此HPV16 E6可能通过抑制miR-218的表达而促进宫颈癌的EMT和侵袭能力,从而促进宫颈癌的转移。这一结果也说明,miR-218抑制宫颈癌的EMT和侵袭能力是受HPV16E6调控的。(5) DCUN1D1在宫颈癌组织中的表达与miR-218的表达呈负相关关系为了进一步研究miR-218与SFMBT1和DCUN1D1两个靶基因的关系,我们应用免疫组化方法检测并分析了SFMBT1和DCUN1D1在宫颈癌组织中与miR-218的相关关系。结果显示,在宫颈癌组织中,DCUN1D1的信号强弱的空间分布与miR-218信号相反,进一步对104例宫颈癌及癌旁正常宫颈组织的DCUNID1信号强弱统计分析发现,miR-218与DCUNID1信号强弱呈负性相关关系(P<0.05)。四、结论本研究中,我们首次揭示了miR-218在宫颈癌EMT和侵袭迁移过程中的作用及其机制。我们发现在宫颈癌中miR-218表达降低,且在宫颈癌中的表达量低于正常宫颈组织。在宫颈癌细胞中,miR-218通过抑制其靶基因SFMBT1和DCUNID1的表达,进而抑制宫颈癌细胞的EMT、侵袭和迁移,最终抑制宫颈癌转移。同时发现,miR-218抑制宫颈癌的EMT和侵袭能力是受HPV16 E6调控的。这些发现揭示了miR-218在肿瘤转移过程中的作用及其机制,并为SFMBT1和DCUNID1在肿瘤转移中的作用提供了理论依据。肿瘤转移是导致肿瘤治疗失败乃至患者死亡的首要原因,该研究将为临床治疗提供参考。