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鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方及东南亚一些地区常见的恶性肿瘤之一。放化疗是鼻咽癌在临床上主要治疗手段，通常对于早期鼻咽癌效果较好，而对于复发或远处转移的晚期患者治疗效果则不尽人意。近年来随着分子生物学、免疫学及病毒学等领域的进展，鼻咽癌的免疫治疗日渐引起肿瘤界的关注。 NPC的发生发展与EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)感染密切相关。EBV在鼻咽癌细胞中仅表达核抗原1(EB nuclear antigen1，EBNA1)和潜伏膜蛋白1、2（latent membrane protein，LMP1，2）几种病毒抗原。LMP2含有CD8+T细胞识别表位，是鼻咽癌免疫治疗主要靶点。我们课题组构建的含潜伏膜蛋白2的重组腺病毒5型疫苗(rAd-LMP2)已完成临床Ⅰ期试验。EBNA1是唯一一种在所有EBV相关肿瘤细胞中都表达的病毒核抗原，含有CD4+T细胞识别表位。将lmp2和ebna1基因融合用于鼻咽癌免疫治疗，可激活CD4+T和CD8+T两种细胞免疫应答。而EBNA1对LMP2诱导的CD8+T特异性的细胞免疫应答的影响，目前尚不明确。鉴此，构建含有CD4+T细胞识别表位ebna1片段的重组腺病毒，探讨其对LMP2特异性细胞免疫应答的影响。 PCR法扩增B95-8细胞株中EBV ebn1的C-端部分片段，经EcoRⅠ和BglⅡ酶切位点插入pDC316穿梭质粒。测序比对正确后，与腺病毒骨架质粒pBHG共转染293细胞。收集病变后细胞，通过流式细胞术和Western Blot检测EBNA1在293细胞中的表达。电镜下观察所获得的重组病毒颗粒大小，TCID50法确定重组腺病毒滴度。以2×108 VP/只剂量，将rAd-EBNA1、rAd-LMP2单独和联合免疫Balb/c小鼠，以PBS组和空病毒(rAd-null)组做为实验对照组。免疫结束后的第1、2、4和8周检测小鼠体内特异性细胞免疫应答的水平。 PCR扩增获得939 bp ebna1片段，通过EcoRⅠ和BglⅡ酶切位点插入，获得重组穿梭质粒pDC316-EBNA1，测序结果与标准株序列一致。pDC316-EBNA1和骨架质粒pBHG共转染293细胞后，细胞出现病变，获得含EBV ebna1基因片段的重组腺病毒(rAd-EBNA1)。流式细胞术和Western Blot检测结果证实，EBNA1在293细胞中表达，电镜下观察到典型的腺病毒颗粒，病毒二代滴度可达108 TCID50/mL。小鼠免疫后结果显示:rAd-EBNA1和rAd-LMP2单独免疫均能激发特异性细胞免疫应答，LMP2高于EBNA1。rAd-EBNA1和rAd-LMP2联合免疫时，不同的免疫顺序所诱导的细胞免疫应答水平不同。第一针免疫rAd-LMP2，第二针免疫rAd-EBNA1组合，诱导的LMP2特异性细胞应答水平高于单独免疫rAd-LMP2和其他联合免疫组合;而同时免疫rAd-LMP2、rAd-EBNA1组合，则低于单独免疫rAd-LMP2。说明不同的免疫顺序对细胞应答起正、负调节作用。 综上所述，含EBV ebna1片段的重组腺病毒疫苗rAd-EBNA1被成功构建，与rAd-LMP2单独及联合免疫小鼠，能诱发EBNA1和LMP2特异性细胞免疫反应。rAd-LMP2和rAd-EBNA1联合免疫小鼠后，EBNA1可能对LMP2细胞免疫应答起着增强或抑制作用。