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研究背景胃肠粘膜损伤是胃肠道疾病的病理基础之一;胃肠粘膜损伤修复包括早期快速修复和后续修复阶段,细胞迁移环节贯穿此两阶段。多胺在大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)迁移的调控中发挥了重要作用,而细胞内游离钙离子([Ca2+]cyt)是多胺调节细胞迁移的关键因素。[Ca2+].yt升高能促进细胞迁移,下调[Ca2+]cyt则抑制细胞迁移。[Ca2+]cyt来源于胞内钙库(内质网、肌质网)的释放和胞外Ca2+内流。磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)能催化水解磷脂磷酰肌醇-(4,5)二磷酸盐(PIP2),产生肌醇(1,4,5)-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG),IP3通过与胞内钙库上的IP3R受体结合,释放钙库内Ca2+,提高[Ca2+]cyt;钙库Ca2+耗竭还能诱导由钙池-操纵性钙通道(SOC)介导的容量性Ca2+内流(CCE)。Rac1能与PLC-γ1相互作用形成Racl/PLC-γ1蛋白复合体,参与调节CCE和[Ca2+]cyt。瞬时受体电位通道1(TRPC1)是SOC的重要组成元件,参与了胞外Ca2+内流调控;RhoA、Cav-1能与TRPC1相互作用,形成RhoA/TRPC1和Cav-1/TRPC1蛋白复合体,促进TRPC1介导的胞外Ca2+内流。脾虚证患者可见胃肠粘膜损伤的病理改变,益气健脾中药能防治胃肠粘膜损伤。课题组前期研究发现四君子汤(君药为人参)多糖能防治吲哚美辛诱导的大鼠小肠粘膜损伤,机制研究提示其作用与影响小肠粘膜多胺和Ca2+含量有关;细胞实验则发现四君子汤、黄芪、白术的多糖提取物能促进细胞迁移,作用机制与影响细胞迁移多胺信号通路Ca2+调控有关;多糖是益气健脾中药的药效物质基础之一。研究目的观察人参多糖对吲哚美辛致小肠粘膜损伤的防治作用,细胞实验则观察人参多糖对IEC-6细胞迁移过程Ca2+调控相关机制的影响,以探讨人参促进小肠粘膜损伤修复的作用机制,为其治疗胃肠粘膜损伤的疗效机制提供参考。研究方法1.人参多糖的提取、分离和纯化:人参经水提醇沉、Sevag法去蛋白和DEAE-52纤维素层析纯化,分别得到人参多糖1、2、3样品;苯酚-硫酸法检测人参多糖三种样品的多糖含量;Folin-酚法检测“人参多糖2”样品的蛋白含量;高效液相凝胶色谱法对“人参多糖3”样品进行纯度分析。2.细胞迁移实验与受试药筛选:在划痕法细胞迁移模型,观察人参多糖三种样品对细胞迁移的影响,并筛选出促进细胞迁移药效最佳的样品作为后续实验的受试药。3.人参多糖防治大鼠小肠粘膜损伤的实验:吲哚美辛5mg/kg/d皮下注射,造模4d,每日造模前1h予人参多糖(5g/kg、15g/kg)灌胃治疗;5d时处死动物,大体观察小肠粘膜损伤情况,并刮取小肠粘膜用于Ca2+含量检测。4.比色法测定大鼠小肠粘膜Ca2+含量。5.Ca2+相关调控指标检测:①Western-blot 检测 RhoA、Cav-1、TRPC1、Rac1和PLC-γ1蛋白表达;②免疫共沉淀法检测RhoA/TRPC1、Cav-1/TRPC1和Racl/PLC-γ1蛋白复合体表达;③观察Rac1活性抑制剂NSC-23766对细胞迁移的影响,并以Western-blot或免疫共沉淀法观察人参多糖对NSC-23766负荷下Rac1、PLC-γ1及其蛋白复合体表达的影响。研究结果1.人参多糖提取、分离和纯化:①人参多糖1、2、3样品得率分别为6.50%、5.06%和2.70%。②人参多糖1、2、3样品多糖含量分别为65.25%、77.38%和97.21%,其中以“人参多糖3”多糖含量最高。2.细胞迁移实验与受试药筛选:人参多糖三种样品均能促进细胞迁移,在动物实验中,选择“人参多糖2”样品作为受试药,设置5g/kg和15g/kg(按照生药量计算)两个剂量组。在后续细胞实验中,选择“人参多糖3”样品作为受试药,设置20、40、80和160mg/L四个剂量组,部分实验设置80mg/L和160mg/L两个剂量组。3.人参多糖对吲哚美辛所致大鼠小肠粘膜损伤的影响:①能减轻大鼠小肠粘膜溃疡损伤;②提高造模大鼠小肠粘膜Ca2+含量。提示人参多糖对小肠粘膜损伤的防治作用,可能与提高粘膜Ca2+含量有关,也为从细胞水平探讨其小肠粘膜保护作用提供了研究基础。4.人参多糖对细胞迁移过程Ca2+调控相关指标的影响:①能促进细胞迁移过程RhoA、TRPC1蛋白表达,提高RhoA/TRPC1复合体表达。②能促进细胞迁移过程Cav-1蛋白表达,提高Cav-1/TRPC1复合体表达。③能促进细胞迁移过程Rac1、PLC-γ1蛋白表达,提高Rac1/PLC-γ1复合体表达。④NSC-23766能抑制细胞迁移并降低Rac1/PLC-γ1复合体表达,人参多糖能逆转NSC-23766对细胞迁移的抑制,提高Rac1、PLC-γ1蛋白和Racl/PLC-γ1复合体表达。提示人参多糖可能通过提高Ca2+调控相关蛋白及其复合体表达,增加Ca2+内流而促进细胞迁移。研究结论人参多糖能促进IEC-6细胞迁移,作用机制与其影响多胺信号通路Ca2+调控有关;人参多糖能防治吲哚美辛所致的大鼠小肠粘膜损伤,并提高小肠粘膜Ca2+含量;提示人参多糖是人参小肠粘膜损伤修复作用的药效成分之一。研究结果为探讨益气健脾中药人参胃肠粘膜保护机制提供了参考。