沙葱萤叶甲Galeruca daurica(Joannis)是一种近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,危害沙葱Allium mongolium、野韭Allium ramosum、多根葱Allium polyrhizum等百合科Liliaceae葱属Alllim植物,严重破坏草原生态环境。嗅觉感受系统对昆虫的生命活动起到了至关重要的作用,昆虫通过嗅觉来感知外界环境中的挥发物质,从而进行信息交流。目前有关沙葱萤叶甲化学感受系统的研究还是空白。本研究从沙葱萤叶甲转录组中鉴定到大量的嗅觉相关基因,并对气味结合蛋白和化学感受蛋白基因的表达谱和原核表达嗅觉相关蛋白与寄主植物挥发物的结合特性进行了分析,为进一步研究沙葱萤叶甲化学感受的分子机理奠定了必要的基础,并对揭示其猖厥成灾机理以及开发利用引诱剂或驱避剂控制其发生危害具有重要的意义。主要研究结果如下:1.沙葱萤叶甲触角感器的显微观察利用扫描电子显微镜对沙葱萤叶甲触角上的感器进行了观察。结果表明,沙葱萤叶甲触角感器主要有5种类型,分别是毛形感器(sensillatrichodea)、刺形感器(sensilla chaetica)、锥形感器(sensilla basiconica)、钟形感器(sensilla campaniformia)和 Bohm 氏鬃毛(Bohm bristle)。2.沙葱萤叶甲嗅觉相关基因的鉴定及分子特性分析从本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组中鉴定到66条嗅觉相关基因,包括29条气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因、10条化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因、21条嗅觉受体(olfactory receptor,OR)基因(包括1条嗅觉共同受体 olfactory receptor co-receptor,ORco)和6条感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因。序列分析结果表明,除OBP29外,其它28个OBP基因均具有完整的开放阅读编码框(open reading frame,ORF),编码氨基酸个数119～202。根据保守的半胱氨酸残基数可将GdauOBP分为Classic OBP和Minus-C OBP两个亚家族。10条GdauCSP基因均具有完整的ORF,编码氨基酸个数98～273,序列中含有四个保守的半胱氨酸。GdauOR基因的ORF均不完整,编码55～259个氨基酸。6个GdauSNMP中,GdauSNMPla和GdauSNMP1b具有完整的ORF,均含有2个跨膜结构域,序列中含有6个保守的半胱氨酸残基。其它4个GdauSNMP基因的ORF不完整,序列中只含有1个跨膜结构域。BlastX验证的最佳结果和系统发育分析均显示,沙葱萤叶甲与大猿叶甲Colaphellus bowringi、榆黄毛萤叶甲Pyrrhalta maculicollis、榆绿毛萤叶甲Pyrrhaltaaenescens等鞘翅目昆虫嗅觉蛋白的亲缘关系最近。GdauORco在系统进化树中与鳞翅目、双翅目、半翅目、直翅目以及鞘翅目其它昆虫的ORco独立地形成一支,表现出极度保守的进化机制。3.沙葱萤叶甲OBP和CSP基因的时空表达格局通过半定量和实时荧光定量技术对沙葱萤叶甲OBP和CSP基因的表达谱进行了分析。结果表明,GdauOBP和GdauCSP基因不仅表达于成虫触角中,还广泛表达于足、翅、头、胸、腹等各部位。各基因在卵、幼虫、蛹和成虫等各发育阶段也有不同程度的表达。超过一半的基因在成虫触角中的表达量最高,且雌雄触角之间的表达水平存在显著差异。同时,大多数GdauOBP和GdauCSP基因在卵和蛹中的表达水平相对较低。4.沙葱萤叶甲OBP和CSP的克隆、原核表达及纯化通过 RACE 技术克隆得到 GdauOBP1、GdauOBBP6、GdauOBP10、GdauOBP20、GdauCSP4和GdauCSP5的cDNA全长序列以及GdauOBP15的ORF序列和3’非编码区,验证了 ORF的完整性。成功构建了重组表达质粒pET-28a(+)/OBP1、pET-28a(+)/OBP6、pET-28a(+)/OBP10、pET-28a(+)/OBP15、pET-28a(+)/OBP20、pET-28a(+)/CSP4和pET-28a(+)/CSP5,通过诱导表达和蛋白纯化得到了可溶性重组蛋白。5.沙葱萤叶甲主要寄主植物挥发物的鉴定及其触角电位反应采用顶空动态收集法和GC-MS技术从沙葱萤叶甲最适寄主植物—沙葱中鉴定出32种挥发性化合物,并从中选取了 13种主要化合物进行EAG测定。EAG测试结果表明,二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、二烯丙基三硫醚、顺-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛7种化合物能引起沙葱萤叶甲触角较为强烈的电位反应。此外,雌性对多数化合物的反应值均高于雄性;当化合物浓度在0.1 mol/L和1 mol/L时,沙葱萤叶甲的触角电位反应较高。6.沙葱萤叶甲OBP和CSP与主要寄主植物挥发物的结合特性荧光竞争结合试验以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)为探针。结果表明,GdauOBP1和GdauOBP1O对所有供试的13种寄主植物挥发物结合能力均较弱(Ki>30μM);GdauOBP6与二甲基二硫醚、己醛、2-己烯醛和顺-2-己烯-1-醇有较强的结合能力,Ki值为 25.65～29.09μM;GdauOBP15特异性地结合二甲基二硫醚,K值为23.09μM;GdauOBP20仅与对二甲苯和环庚三烯有较强的结合能力,Ki值分别为22.91 μM和26.55 μM。两个CSP对寄主植物挥发物的结合能力差异很大,GdauCSP4对所测化合物具有广谱的结合能力,能与其中9种配体较好地结合,K值为12.06 μM～21.32 μM,其中结合能力最强的配体是苯甲酸甲酯,其次为己醛;而GdauCSP5的结合谱较窄,仅能较好地结合二甲基二硫醚和2-己烯醛,Ki值分别为26.47μM和25.28 μM。所有7个重组蛋白与二烯丙基硫醚、月桂烯和二烯丙基三硫醚的结合能力均较弱(Ki>30 μM)。