白念珠菌是一种常见的人类致病真菌。它在侵袭宿主的过程中可以进行酵母态-菌丝态的形态转换,该形态转换也是白念珠菌致病机制研究的重点。本课题前期研究利用线虫模型筛选白念珠菌基因突变菌库,试图发现影响致病力的关键因子,研究发现白念珠菌SDH2基因突变菌在线虫模型上致病力完全丧失且菌丝形成能力产生缺陷,具有研究价值。SDH2基因参与编码的蛋白同时在三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)循环和线粒体电子传递链(Electron transport chain,ETC)中发挥功能,在TCA循环中是琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH),同时还是线粒体电子传递链的复合体II,是有氧呼吸过程中发挥重要作用的酶。我们前期以野生型白念珠菌SC5314为亲本菌,利用SAT-flipper方法重新构建了SDH2缺失菌sdh2Δ/Δ。该基因敲除方法的优势在于利用诺尔丝菌素(Nourseothricin)抗性标记筛选阳性克隆,诺尔丝菌素抗性标志基因可在后续实验中被完整剔除,避免营养缺陷标志基因对致病力的干扰。在线虫模型和小鼠模型上,sdh2Δ/Δ致病力显著降低并且菌丝形成能力缺陷。在体外实验中,我们发现sdh2Δ/Δ在不同是菌丝诱导培养基上都显示出菌丝形成能力缺陷,且利用非发酵碳源障碍。但值得注意的是,在含可发酵碳源葡萄糖的菌丝诱导培养基上,sdh2Δ/Δ依然不能形成正常的菌丝。我们深入研究了SDH2基因影响菌丝形成的机制。由于sdh2Δ/Δ的生长在很大程度上依赖可发酵碳源,我们首先考察了SDH2基因缺失菌的固体菌丝形成缺陷是否与糖酵解的代谢产物乙醇有关。我们推测sdh2Δ/Δ中乙醇可能发生了累积,依据是敲除SDH2基因后TCA循环中SDH的功能受到影响,可能导致TCA循环受阻,从而影响白念珠菌有氧呼吸过程,其代谢方式可能由有氧呼吸转变为糖酵解,在固体培养基上,糖酵解产生的乙醇副产物很可能积累在细胞内不能及时排出。经检测发现,SDH2基因缺失菌的确存在胞内乙醇累积的现象,接下来我们通过3部分实验对乙醇与白念珠菌菌丝形成的关系进行探究:(1)外加乙醇考察固体菌丝形成;(2)利用工具药丙二酸(琥珀酸类似物,竞争性抑制琥珀酸脱氢酶活性从而阻断TCA循环过程)阻断有氧呼吸过程考察胞内乙醇含量和固体菌丝形成;(3)考察ADH1基因(编码乙醇脱氢酶,催化乙醛还原到乙醇及其逆反应)敲除菌adh1Δ/Δ胞内乙醇含量和固体菌丝形成,但得到的结果不能支持这个结论。首先,我们发现在不同固体培养基中,乙醇对菌丝的影响并不一致,2~4%的乙醇在YPD+胎牛血清培养基中反而刺激了菌丝的形成。其次,丙二酸确实能够抑制有氧呼吸过程,并令胞内乙醇累积,但相应的固体菌丝形成并没有产生缺陷。此外,adh1Δ/Δ胞内乙醇含量明显低于野生型白念珠菌,但固体菌丝形成能力并没有更强,且对外加乙醇的敏感性也并没有低于野生型。总的来说,白念珠菌胞内乙醇含量与菌丝形成能力没有明确的正相关关系。由于SDH2基因同时在TCA循环和ETC发挥作用,我们进一步探究了是TCA循环还是ETC功能受损影响了菌丝形成。本部分实验选取丙二酸(Malonate)和萎锈灵(Carboxin)两种SDH不同功能位点的特异性抑制剂,和白念珠菌TCA循环特异性基因FUM12敲除菌fum12Δ/Δ作为考察工具。丙二酸特异性抑制SDH在TCA循环中催化琥珀酸脱氢为延胡索酸的功能,萎锈灵特异性抑制SDH在ETC中传递电子到泛醌的功能,FUM12基因编码TCA循环中延胡索酸脱氢酶,基因敲除后TCA循环受阻。我们发现野生型白念珠菌施加1.5 mM的萎锈灵后,菌丝形成能力显著下降并导致致病力降低,能够重现出SDH2基因敲除后致病力和菌丝形成能力缺陷的现象,而相同浓度下丙二酸和敲除FUM12基因不能够影响白念珠菌致病力和菌丝形成能力。由此我们推断,sdh2Δ/Δ中ETC的功能受损是导致菌丝缺陷的主要原因,而菌丝形成主要与ETC相关,而非TCA循环过程。我们进一步研究了ETC功能影响菌丝形成机制。我们首先考察了sdh2Δ/Δ一系列线粒体功能指标和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生,发现sdh2Δ/Δ的ATP含量和线粒体膜电位与野生型没有显著差别,但ROS含量明显高于野生型,排除了ATP不足以及线粒体膜电位异常导致基因缺失菌菌丝缺陷的可能,并推测ROS积累是可能原因。我们通过对sdh2Δ/Δ外加还原性物质(维生素E,原花青素)和对野生型外加ROS诱导物质改变胞内ROS水平,考察内源性ROS对固体菌丝形成能力的影响。发现外加还原性物质后sdh2Δ/Δ菌丝形成能力能够恢复,且ROS诱导物质的确可以抑制白念珠菌菌丝形成。此外,我们通过降低环境中氧含量(缺氧条件,20%CO2)减少有氧呼吸进而减少胞内ROS产生,研究发现sdh2Δ/Δ在低氧条件下菌丝形成能力与野生型无异。综合上述实验结果,我们推测白念珠菌SDH2基因敲除后造成ROS积累是导致菌菌丝形成缺陷的主要原因。本课题揭示了SDH2基因敲除后通过影响ETC功能提高了细胞内ROS产生,从而导致白念珠菌菌丝形成能力以及致病力显著下降。该研究提示白念珠菌线粒体电子传递链相关基因可能成为新型抗真菌药物作用的靶点。