长雄野生稻基因组、转录组分析及植物CRISPR-Cas载体快速克隆体系的建立

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长雄野生稻(Oryza longistaminata)是分布于非洲大陆及马达加斯加岛的具有AA基因组的野生稻,拥有众多优异的性状,如地下茎性状、自交不亲和性状以及对众多非生物与生物胁迫的抗性等。解析长雄野生稻的基因组将是理解这些优异性状并加以利用的关键一步,然而基因组的高杂合度是解析这些性状的很大障碍。在本次工作中,使用了大量的二代测序数据(~396×Illumina短读长以及~5.9× Roche GS FLX+长读长)组装了长雄野生稻的基因组。利用目前已经发布的其他3种稻属物种基因组数据,比较了4种稻属物种中抗性基因的数目,发现长雄野生稻拥有最多的抗性基因。为了揭示地下茎及自交不亲和性状的机制,测定了4组共8个组织的转录组数据(地下茎vs.地上茎,地下茎尖vs.地上茎尖,长雄野生稻的雄蕊vs.自交亲和后代的雄蕊,长雄野生稻的雌蕊vs.自交亲和后代的雌蕊;此处的自交亲和后代是指长雄野生稻与水稻籼稻RD23杂交后代中可以自交亲和的单株)并进行了比较转录组学的研究,鉴定了可能影响地下茎和自交不亲和性状的候选基因。同时,使用长雄野生稻作为外群,分析了亚洲栽培稻驯化基因的进化历程,发现:PROG1可能是从普通野生稻中进化出来的新基因,使其进化出了匍匐株型来适应沼泽的生长环境;而后功能丧失型的PROG1又在亚洲栽培稻的驯化过程中受到强烈的人工选择以满足人工密植的直立株型的需求,第一次在植物中展现了一个新基因能够控制植物关键的适应性形态性状。本文研究得到的长雄野生稻基因组及相关组织的转录组数据为研究并挖掘长雄野生稻优异的基因资源及稻属的进化提供了重要的数据。  CRISPR-Cas基因组编辑系统已经在模式植物及主要作物中广泛应用。对于农杆菌转化体系,通常将cas9元件与gRNA元件整合入双元载体需要多步克隆,实验周期长且实验成本高。在本次研究中,开发了一套基于一步克隆法的植物CRISPR-Cas克隆体系PLANTCRISPR-CLONING,并且在水稻和烟草中验证了其高效的基因打靶效率。同时,对模式植物水稻(粳稻和籼稻)、拟南芥和烟草基因组中所有注释基因的潜在PLANTCRISPR-CLONING靶点进行了特异性分析,发现基因组中绝大部分基因都拥有特异性的靶点。植物PLANTCRISPR-CLONING克隆体系的应用将对植物学家研究基因功能及作物改良提供新的选择。
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