肿瘤的生长需要血管为之提供营养和排除代谢产物。研究表明，至少有30种生长因子与肿瘤的血管生成有关，其中最直接的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。如何阻断肿瘤血管的生成已成为目前肿瘤研究领域的一个重要课题。 抑制肿瘤血管生成药物的筛选依赖于体内或体外的实验方法，体内模型中鸡胚尿囊膜(CAM)生成实验占有优势，是大量初筛抗血管生成药物的良好模型；体外研究模型中一般首先采用噻唑蓝(MTT)实验检测抑制血管内皮细胞生长的药物。 在新血管的发生过程中，血管内皮细胞增殖是最基本和最重要的环节。由于肿瘤细胞和血管内皮细胞互相依赖介导了肿瘤血管新生。因此，研究体外肿瘤血管新生，要求模拟体内与肿瘤细胞共生的过程，即：血管内皮细胞与肿瘤细胞在共培养的条件下生长。 中医理论认为“血瘀证”为肿瘤的基本证型，活血化瘀法在抗肿瘤的研究中占有重要地位。红花是传统的活血化瘀类中药，临床上用于大肠癌等多种恶性肿瘤，但其作用机制鲜见相关报道。羟基红花黄色素A(HSYA)是红花的主要有效成分，目前有关HSYA作用的文章尚篇数不多。对于HSYA抑制新生血管形成的作用，国内外尚未见报道。 本研究通过预实验，首次从十味活血化瘀中药或中药有效组分中，筛选出HSYA能显著抑制CAM新生血管的生成及人脐静脉内皮细胞的增殖。为进一步探讨HSYA对肿瘤细胞的作用情况及作用机理，本研究将肿瘤细胞上清液加入到血管内皮细胞中，建立了异常增殖血管内皮细胞模型，通过MTT实验、荧光定量PCR和ELISA实验观察HSYA对正常及异常增殖血管内皮细胞的作用及作用机理，在基因表达及蛋白表达两个层次上探讨HSYA抑制新生血管可能的作用机理。本实验分为三部分： 第一部分，HSYA影响鸡胚尿囊膜血管生成的机理研究 由于新生血管与bFGF、VEGF及其受体的关系最为密切，本实验设计了bFGF、VEGF及其受体的引物，利用CAM血管生成实验，直接从富含血管的CAM组织上取材，通过RT-PCR实验，观察HSYA对CAM组织中上述三个基因表达的影响。结果表明，HSYA能显著抑制CAM毛细血管中bFGF、VEGF及VEGF受体flt-1的mRNA表达，尤其是对bFGF mRNA的表达明显呈抑制作用，与正常组相比，呈极显著性差异。 第二部分，HSYA在生理及病理条件下对培养ECV304的作用 由于肿瘤血管的生成由血管内皮细胞异常增殖开始的，因此，抑制血管内皮细胞增殖就可以抑制新生血管生成。本实验通过MTT法，观察了不同浓度的HSYA对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的作用，结果表明，低浓度的HSYA(5.35mg／L～0.16mg／L)表现出有抑制ECV304生长的作用，并且抑制强度与浓度呈反比，当HSYA的浓度在0.66mg／L～0.16m/L之间时，对ECV304细胞的抑制作用最强，呈极显著抑制(p＜0.001)。 为了进一步探讨HSYA对肿瘤血管内皮细胞的作用，本实验将肿瘤细胞上清液加入到血管内皮细胞中，建立了异常增殖血管内皮细胞模型，通过MTT实验观察HSYA对内皮细胞的作用。结果表明：不加中药的肿瘤组内皮细胞增长迅速，与对照组比较，经墓红花黄色素A对血管内皮细胞调控机理的研究呈极显著促进作用印<0.001)。而加入了经基红花黄色素A的中药组，均呈现出不同程度的抑制作用，尤其是0.66m岁L和0.33mg几两个浓度的HSYA组，与肿瘤组相比显示出极显著抑制内皮细胞的生长的作用印<0.001)。 第三部分经墓红花黄色素A抑制新生血管增殖的机理研究 为了深入探讨HSYA抑制生理及病理情况下内皮细胞增殖的调控机制，本实验设计了与血管内皮细胞生长有关的数个墓因的引物和数个细胞因子，通过上述建立的正常与异常增生血管内皮细胞模型，利用荧光定量PCR实验和EUSA实验，从墓因表达及蛋白表达的两个层次探讨HSYA抑制内皮细胞增殖的可能的作用机理，阐明红花抗肿瘤的可能的分子机制.结果如下: 荧光定量PCR实验的结果:在共培养细胞模型中，0.“m叭、0.33m叭浓度的HSYA对血管生成促进因子vEGF及其受体KDR、bFGF及其受体bFGFR和癌墓因c一my。及硫酸乙酞肝素蛋白聚糖2(HSPGZ/Perlecan)的角RNA表达具有抑制作用;对野生型抑癌墓因p53 mRNA的表达具促进作用.说明HSYA能抑制新生血管的生成及肿瘤细胞(L 5180)上清液刺激下血管内皮细胞(E Cv3o4)的增殖，其可能的作用机理之一是由于HsYA抑制了与增殖相关的早期反应墓因c一myom丑NA的表达，进而抑制了vEGF、bFGF等生长因子mRNA的表达;之二是HSYA通过促进野生型p53基因的表达，来抑制VEGF启动子的活性，进而抑制VEGF的表达;之三是HSYA通过在RNA水平上的调控，降低HSPG的表达，减少了与bFGF的结合，进而减少了bFGF的释放。 EUSA实验的结果:由于Rl;PCR结果只能反应出各基因在RNA水平上的调控情况，而RNA的表达和蛋白质的表达有时是不一致的，为了更深入地探讨HSYA的作用机理，本实验检测了VEGF、bFGF等6个与血管内皮细胞生长有关的细胞因子的表达，进一步在蛋白质水平上探讨HSYA抑制新生血管生成的作用.结果表明:在共培养细胞模型中，0.“m澎L、o.33m叭浓度的HsYA对血管生成促进因子vEGF及其受体flt一1、bFGF?