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白介素-18(interleukin-18,IL-18)是白细胞介素中的一种,因其能够诱导T细胞产生大量IFN-γ最初被称为IFN-γ诱生因子。IL-18在增强免疫、抗肿瘤、抗病原微生物感染、抑制病毒活性等方面有着潜在的应用前景。γ干扰素(IFN-γ)也称为免疫干扰素,具有抑制病毒的复制、抗肿瘤、抗寄生虫及免疫调节等作用。本试验将pIL-18和pIFN-γ基因分别在乳酸乳球菌表达系统中分泌表达,对其生物学活性进行检测,并将pIL-18、pIFN-γ蛋白与猪伪狂犬病活疫苗联合使用,分析评价其对疫苗免疫效果的影响。本研究首先通过无菌提取猪脾脏淋巴细胞总RNA,根据pIL-18和pIFN-γ基因序列设计引物,经RT-PCR扩增pIL-18和pIFN-γ基因。将pIL-18和pIFN-γ基因与表达载体pProExHTa连接,构建重组表达质粒pProExHTa-pIL-18、pProExHTa-pIFN-γ,并转入大肠杆菌,经诱导表达pIL-18、pIFN-γ蛋白,SDS-PAGE结果显示蛋白表达。表达蛋白经纯化后肌注小鼠,制备出pIL-18、pIFN-γ的抗血清,测得血清效价为1：25600。本研究进一步以pH诱导的乳酸乳球菌分泌型质粒pAMJ399作为表达载体,构建了重组质粒pAMJ399-pIL-18、pAMJ399-pIFN-γ,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,构建重组乳酸乳球菌pAMJ399-pIL-18/MG1363、pAMJ399-pIFN-γ/MG1363,通过自身产酸启动诱导。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,在重组菌诱导表达后的培养上清和菌体沉淀中均检测到19.25ku和17.71ku的特异蛋白反应条带,证明pIL-18、pIFN-γ蛋白在重组乳酸乳球菌中获得了表达,且表达蛋白既可以在菌体内表达,也可以分泌到培养上清中。为检测重组乳酸乳球菌表达pIL-18、pIFN-γ的抗病毒活性,将重组菌诱导的菌液上清,过滤除菌后通过倍比稀释与Vero细胞共孵育24h,分别接种猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)和猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus)进行攻毒,检测pIL-18、pIFN-γ蛋白的抗病毒活性,60h后显微镜下观察细胞病变情况,结果表明经过pIL-18、pIFN-γ孵育后,细胞生长状况良好,而未添加pIL-18或pIFN-γ的对照组细胞发生明显病变,细胞皱缩、变圆、聚集、脱落；经MTT法检测,统计结果分析,pIL-18、pIFN-γ孵育组与病毒对照组相比,差异极显著(P<0.01),证明重组乳酸乳球菌分泌表达的pIL-18和pIFN-γ蛋白具有良好的抗病毒活性。为进一步研究pIL-18和pIFN-γ的免疫佐剂作用,将重组菌诱导表达后,浓缩培养上清,分别与猪伪狂犬病活疫苗联合免疫小鼠,同时设PBS对照组、单独疫苗组和疫苗与pAMJ399/MG1363联合免疫组。采用肌肉注射的方式进行免疫,在初免后两周加强免疫；并于免疫前和初次免疫后第7d、14d、21d、28d采集小鼠血清,利用间接ELISA方法检测特异性抗体水平,结果表明,疫苗与pIL-18、pIFN-γ联合免疫组抗体水平均高于单独疫苗组。在不同联合免疫组中,pIL-18和pIFN-γ共同免疫组抗体水平要明显高于其他五组,且与单独疫苗组相比差异极显著(p<0.01),单独pIL-18组、单独pIFN-γ组与单独疫苗组相比,差异显著(p<0.05)。同时应用细胞中和试验对抗体的中和效价进行检测,单独疫苗组血清抗体中和猪伪狂犬病毒的效价为1：45.26,疫苗与pAMJ399/MG1363联合免疫组中和效价为1：44.74,疫苗联合pIL-18免疫组中和效价1：62.6,疫苗联合pIFN-γ免疫组中和效价1：53.4,疫苗联合pIL-18、pIFN-γ免疫组中和效价为1：66.36。利用MTT法检测免疫后小鼠脾淋巴细胞的增殖情况,结果显示,在低浓度(1μg/mL)和中浓度(5μg/mL)抗原的刺激下,疫苗与pIL-18和pIFN-γ联合免疫组的脾淋巴细胞增殖刺激指数较单独疫苗组、疫苗与pAMJ399/MG1363联合免疫组差异极显著(p<0.01)。表明疫苗与pIL-18和pIFN-γ联合免疫组诱导机体产生了更高的特异性免疫应答水平。在初次免疫后28d,进行攻毒保护性试验,观察不同组小鼠发病和死亡的情况可知,单独疫苗组、疫苗与pAMJ399/MG1363联合免疫组攻毒保护率达83%,疫苗与pIL-18和pIFN-γ联合免疫组攻毒保护率可达100%。以上结果证明猪白介素-18、猪γ-干扰素具有较好的免疫佐剂效应。综上,本研究的试验结果表明,通过乳酸乳球菌分泌表达了pIL-18和pIFN-γ蛋白,经检测具有良好的生物活性,与疫苗联合使用时具有良好的佐剂特性,为pIL-18和pIFN-γ作为免疫佐剂的应用提供了实验数据和理论依据,并为其他疫苗佐剂的研究奠定了基础。