手足口病(Hand,FootandMouthDisease,HFMD)是一种由人肠道病毒引起的全球性传染病,主要发生于5岁以下的婴幼儿,严重危害公众健康。我国是HFMD的主要流行地区,近年来每年的报告病例均在百万以上。导致HFMD疫情的肠道病毒有多种,除了肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇A组16型病毒(CVA16),近年研究显示柯萨奇A组6型病毒(CVA6)已成为HFMD的主要病原体,亟需研制有效的预防疫苗或治疗药物。然而,目前对于CVA6的病毒颗粒结构特征、优势中和表位、抗原性特征等研究尚属空白,制约了相关防治方法研究。为此,本研究应用生物化学、细胞生物学和结构生物学等技术开展了 CVA6的病毒颗粒结构与优势中和表位研究,揭示CVA6的病毒颗粒特性及疫苗应用潜能,获得CVA6颗粒及优势中和表位的高分辨率结构,初步阐释中和抗体作用机制,为相关新型疫苗和治疗药物的研制提供重要基础。本研究首先开展了 CVA6的病毒颗粒鉴定与疫苗应用潜能研究。在已有工作基础上,本研究建立了较为高效的CVA6病毒的规模化培养体系,制备获得较高滴度的培养病毒。应用密度梯度超速离心、分析型超速离心和生物化学分析等方法,本研究发现CVA6在细胞培养过程中主要存在2种颗粒类型,其沉降系数分别为84S和128S。其中,84S颗粒的电镜负染观察呈现为空心结构,128S颗粒呈现为实心结构。分析显示,84S颗粒的组分为VP0、VP1和VP3抗原,不含病毒RNA;128S颗粒的组分为VP1、VP2和VP3,包含病毒RNA。体内外感染实验结果证明128S颗粒具有感染活性。根据上述特征,本研究初步认为CVA6的84S和128S颗粒分别符合肠道病毒颗粒类型中的前体病毒衣壳(Procapsid)和脱衣壳中间态(A-particle)的特征。值得注意的是,目前已分析的肠道病毒的感染性病毒颗粒通常为成熟病毒颗粒(Mature virion),A-particle被认为是一种过渡中间态,在自然培养情况下难于大量稳定存在。然而,CVA6培养病毒中的感染性病毒颗粒却主要以A-particle形式稳定存在。进一步分析也显示,CVA6的上述两种颗粒均具有较好的稳定性。本研究分别评价了 CVA6上述两种颗粒的免疫原性。结果显示,CVA6的84S和128S颗粒均具有良好的免疫原性,灭活抗原结合铝佐剂可免疫激发较强的中和抗体,并且在CVA6乳鼠感染模型中显示出良好的免疫保护性。上述结果初步证明了,CVA6的两种不同病毒颗粒均具有较好的免疫原性,具有良好的疫苗应用潜能。本研究进一步应用冷冻电镜技术揭示CVA6病毒颗粒的结构特征。本研究分别获得了 CVA6的84S和128S颗粒的近原子分辨率结构,分辨率分别为3.3 A和3.1 A。通过结构比对分析,本研究验证了 CVA6的84S和128S颗粒确实符合肠道病毒Procapsid和A-particle的颗粒结构特征,例如CVA6 128S颗粒具有二倍轴和准三倍轴张开孔洞,VP1峡谷下方塌陷的疏水口袋区域等特征均符合典型的肠道病毒A-particle的结构特征。对比分析显示,上述两种病毒颗粒的表面结构特征高度相似,为解释两种颗粒具有相似的良好免疫原性提供了结构基础。分析也发现,CVA6A-particle与其它已知肠道病毒颗粒结构最显著的差异位于VP1抗原表面的4个loop区(BC,DE,EF和HI),上述loop区一般为肠道病毒的优势抗原表位区,在肠道病毒感染宿主细胞的过程具有重要作用。本研究也初步揭示了 CVA6 A-particle的病毒衣壳蛋白与病毒基因组RNA的相互作用特征,CVA6除了二倍轴下方的VP2抗原N-端的Glu37和Trp38可与病毒RNA相互作用,同时在肠道病毒中也首次发现五倍轴下方的VP3抗原N-端的PrO3位点可与病毒RNA存在显著的相互作用。本研究进一步通过解析CVA6病毒颗粒与优势中和抗体复合物的高分辨三维结构鉴定CVA6的优势中和表位。在前期工作基础上,本研究发现单克隆抗体1D5对CVA6具有较高的中和活性,同时对CVA6的两种类型颗粒均具有较强的亲和力,血清阻断实验结果同时也显示1D5所识别的表位为CVA6的优势中和表位。本研究应用冷冻电镜技术对CVA6 A-particle-1D5复合物进行了结构解析,并获得了高分辨率结构(3.8A),该分辨率在目前已知的病毒抗体复合物结构研究中为最高。分析显示,Fab-1D5的结合表位区域位于CVA6 A-particle的五倍轴顶端,涉及VP1抗原表面的4个loop区,分别为BC,EF和HI loop以及相邻原体的VP1抗原的DEloop,上述区域均为肠道病毒的关键抗原表位区。分析显示,VP1 抗原的 BC loop 的 Leu98 和 Asp99,EF loop 的 Asp159、Gly160 和 Tyr164,HI loop的Ser236和Thr237为影响CVA6 A-particle与Fab-1D5结合关键氨基酸,抗体逃逸突变实验的分析结果证明了 L98P和G160D的突变确可显著影响单抗1D5对CVA6的中和能力。分析也显示,Fab-1D5分子的轻链和重链的五个环区均参与了 Fab与病毒颗粒的相互作用,相互作用界面中主要的作用力包含范德华力和8个氢键,同时Fab分子之间通过轻链的Aspl和Tyr66也形成了氢键相互作用,该结合方式可赋予1D5对CVA6具有较强的结合能力,可能通过稳固病毒颗粒阻止CVA6 A-particle的构象变化从而阻断病毒的感染。本研究进一步通过病毒颗粒热稳定性检测分析显示单抗1D5确实可以稳固病毒颗粒。细胞吸附实验分析也显示,单抗1D5在CVA6病毒吸附细胞前后均具有较好的抑制活性,可阻断CVA6与细胞的结合。上述结果说明,单抗1D5可能通过作用于CVA6的关键表位区域,阻断病毒与宿主细胞的相互作用并稳定病毒颗粒阻止变构从而发挥中和作用。综上所述,本研究首次揭示了 CVA6具有两种病毒颗粒类型,具有独特的以A-particle为主要感染性病毒颗粒组分的特征,并证明上述病毒颗粒均具有良好的疫苗应用潜能。本研究也首次获得了 CVA6病毒颗粒及其与优势中和性单克隆抗体的高分辨率结构,揭示了病毒颗粒与优势中和表位的精确结构特征,并初步阐释了中和抗体的作用机制。本研究结果可为研制CVA6预防疫苗和治疗药物,以及病毒组装和感染机制提供重要基础。