鼻咽癌是华南地区常见头颈部恶性肿瘤，放疗是目前首选的治疗方法，近年单纯放疗5年生存率一直徘徊在50-60﹪之间，早期效果较好，中晚期效果明显降低，第二次放疗仅25﹪患者有效，5年生存率下降为12～23﹪，且放射损害性大，第三次放疗则基本无效，因此许多肿瘤学家致力于寻找有效的化疗方案，但研究结果并不一致，肿瘤局部复发与远处转移仍是鼻咽癌治疗失败的主要原因，因此探寻更有效的治疗方法仍是目前鼻咽癌研究的重点与热点。 肿瘤基因治疗成为近20年来的热点，许多基因治疗方案也从实验室进入临床实验阶段。自杀基因疗法是其中研究比较多的一种肿瘤基因疗法，其原理是将一些病毒或细菌基因组中的前药转换酶基因导入肿瘤细胞，这种基因可以编码特殊的酶，将原先无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的，由于肿瘤自杀基因治疗疗效确切，一些研究已进入临床Ⅱ/Ⅲ期阶段。 Epstein-Barr病毒(EBV)和NPC有着密切的关系，在EBV诱导NPC细胞所表达的特异性抗原中，核抗原1(Epstein-Barr nuclear antigen 1，EBNA1)是唯一在潜伏感染和裂解性感染时都表达的核蛋白，其生理作用是维持潜伏感染时EBV拷贝数的稳定，并有利于EBV在宿主细胞中的免疫逃逸。Cp是负责EBNA1基因转录的一个启动子，其DNA序列存在多个EBNA1基因表达的调控位点，因此我们在本研究中采用Cp的-248bp至+76bp序列作为自杀基因的特异性启动子，构建CD-TK双自杀基因靶向腺病毒载体Ad-Cp-CDglyTK，探讨Cp启动子能否特异性调控自杀基因在转染鼻咽癌细胞中表达，从而达到靶向性治疗鼻咽癌的目的。 第1章重组腺病毒质粒pDC316-Cp-CDglyTK构建高保真PCR(polymerase chain reaction)扩增tk基因，回收PCR产物并用HindⅢ+SalⅠ进行酶切，再回收产物，同时采用HindⅢ+SalⅠ酶切穿梭质粒pDC3 16，回收线性化载体片段，T<,4>DNA连接酶进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5 α，挑取克隆，抽提质粒DNA，得到重组质粒pDC316-TK，再用EcoRI+HindⅢ酶切所构建质粒，回收线性化质粒片段。同时高保真PCR扩增cd基因，回收并用HindⅢ+EcoRⅠ酶切，回收片段，与pDC316-TK酶切线性化片段经过连接、转化、筛选等方法得到重组质粒pDC316-CDglyTK，XbaⅠ+EcoRⅠ酶切质粒，回收线性化片段以备用。另外，高保真PCR扩增Cp启动子，XbaⅠ+EcoRⅠ酶切PCR产物，回收产物，与pDC316-CDglyTK酶切片段经过连接、转化、筛选等方法到重组质粒pDC316-Cp-CDglyTK。重组质粒经过PCR电泳、酶切电泳法及DNA测序法等证明tk、cd、cp基因序列插入方向正确。 第2章重组腺病毒AdCp-CDglyTK包装纯化当HEK293细胞长至80～90﹪融合时，取骨架质粒pBHGlox(delta)E1、E3Cre和质粒pDC316-CP-CDglyTK，用Lipofectamine2000脂质体进行转染293细胞，2h后换成含5﹪的培养液，培养10～14天至出现细胞病变效应(CPE)，收集病变细胞，37℃、-70℃反复冻融3次，取1/3病毒上清液再感染293细胞进行大量扩增，3天后收集细胞，PBS重悬，反复冻融3次，最后CsC1梯度离心纯化，-80℃保存备用。扩增后的病毒滴度采用快速腺病毒滴度TCID50检测试剂盒进行测定，病毒滴度为5.6×10<9>TCID50/ml。 第3章逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CDglyTK基因体外表达CNE1、NP69细胞于对数生长期分别加入病毒载体(MOI为100∶1)，感染2h，吸去上清，加入培养液继续培养48h后，收集细胞，抽提细胞总RNA，两组细胞各取总RNA1μg于20μl逆转录体系中合成cDNA，各组取cDNA模板2μl在25μl体系中进行PCR反应。上游引物序列为5’-tgacttactggcaggtgctg-3’，下游引物：5’-atgetgcccataaggtatcg-3’，预期扩增针对tk基因的约300bp片段。PCR产物进行2﹪琼脂糖凝胶电泳。RT-PCR结果示鼻咽癌细胞转染电泳图中300bp处为预期条带，证明CNE1细胞内成功转入融合基因，而NP69细胞株未表达Cp-CD-TK基因。 第4章 MTT法观察Ad-Cp-CDglyTK/5-FC+GCV体外抑制CNE细胞作用CNE1细胞株实验共分GCV、5-FC、GCV+5-FC三组，GCV的终浓度分别为2、10、25、50、75、100、200μg/ml，5-FC的终浓度分为20、50、100、200、400、800、1600μg/ml， NP69细胞株作为对照组，只采用GCV+5-FC联合用药方式，GCV、5-FC终浓度同上。 取对数生长期CNE1细胞进行消化计数，按3000个细胞/孔接种于含10﹪胎牛血清的RPMI-1640培养液96孔培养板中，NP69细胞则采用Keratinocyte-SFM无血清培养液，于37℃、含5﹪CO<,2>的条件下培养，镜下观察细胞生长到80﹪的融合度时，病毒原液用相应的培养液稀释后(MOI为100)感染细胞，24小时后按上述设计方案分别给予GCV、5-FC前体药进行处理，每孔总量为200μl，继续培养72 h，提前4 h每孔加入10μl 10mg/ml MTT溶液，吸去上清，每孔加入150μlDMSO液，震荡5min，待蓝色溶解后，测定各孔0.D<,570>值，计算相对抑制率后绘制剂量-效应曲线，数据用SPSS10.0软件进行统计学处理，组问数据比较采用x<2>检验。 结果：重组腺病毒感染CNE1与NP69细胞株后，单独GCV、5-FC给药组对CNE1都具有较高的抑制作用，但两者之间未见明显统计学差异(P>0.1)，联合用药组对CNE1的抑制作用最强，与单独用药有明显统计差异(P<0.05)，NP69细胞株对GCV+5-FC联合用药未表现出明显的敏感性，与其他三组也有明显统计学差异(P<0.05)。 结论：Cp启动子可以特异性调控CDglyTK融合自杀基因在鼻咽癌细胞株CEN1中表达，融合自杀基因/前药系统较单一基因对鼻咽癌细胞具有更强的杀伤作用，本研究为以后的动物实验奠定了理论基础。