地雷是一种常见的隐蔽性极高的防御性爆炸火器。早在公元1130年就有地雷使用的相关记录。19世纪中叶以后,烈性炸药2,4,6-三硝基甲苯的发现,推动了地雷制式化、多样化的发展,地雷作为一种廉价、高效的防御武器一直沿用至今。地雷的应用对现代战争产生了巨大的推动作用,地雷以其高隐蔽性和高杀伤性的优势,使其几乎受到了历次现代战争的青睐,因此如何在战场上安全、有效地侦测出地雷埋藏位置,是所有交战双方必须解决的问题。此外,地雷对有生力量的杀伤作用并不仅仅在战争过程中,地雷的长效性和杀伤性并不随战争的结束而终结,许多地雷在战场上并未引爆或排除,这些遗留地雷至今仍在威胁着当地人民的生命安全。因此针对地雷安全、有效的侦测方法一直是各国军事武器专家广为研究的课题。传统的地雷检测方法有生物探测、金属探测、声波探测、雷达探测等,这些传统的探测手段有一定的局限性。生物探测主要基于动物对于气味的感官反应,由于动物思想不可控制,探测具有很大的不确定性;金属、声波和雷达探测主要基于探测者的主观判断,并且大多数情况下需要身赴雷区,具有很大的危险性,并且无法针对目前出现的陶瓷、塑料等新型材质的地雷进行探测。为了解决以上这些问题,基于合成生物学的地雷检测方法应运而生。该方法可依据地雷的爆炸填充物为靶标化合物进行检测,规避了地雷材质的问题。利用细菌进行群体检测可以有效地避免个体主观差异对探雷的影响,提高地雷检测的客观准确性,可以与传统的地雷检测方法互为补充,进而提高地雷检测的准确性和安全性。合成生物学是20世纪发展起来的一门基于生命科学的多学科交叉新兴学科。目前合成生物学的研究内容主要可以分为以下三个层次:一是对自然界已知功能的生物元件进行标准化设计,进而形成模块,根据工程学思想,自下而上进行逐级组装,构建出具有全新功能的基因线路或生命系统;二是随着基因合成技术的发展,通过人工设计、合成、组装新的生命体基因组,实现生命体的重构;第三个层次建立在前两个层次的基础上,创造完整的全新生物系统,乃至人工生命体。生物传感器的构建系基于合成生物学研究内容的第一层次,通过挖掘自然界中对靶标化合物敏感的感应元件与适于体现感应强度的报告元件进行组装,通过对报告元件所产生信号的读取分析,感应出靶标化合物的浓度、位置等信息。本研究拟构建的地雷探测生物传感器也主要由感应元件和报告元件构成,目前生物传感器报告元件的发展已经比较成熟,主要有lux CDABE、GFP、lac Z等。我们的研究主要以地雷的常规爆炸装填物2,4,6-Trinitrotoluene(TNT)为靶标分子,挖掘自然界存在的感应元件,并对其进行一系列分析和改造以提高感应活性,或通过自然界中已有报道的一些可感应TNT的调控线路,构建基因传感线路,最后围绕合成生物学生物传感器的构建,搭建可用于细菌自裂解的基因模块,以期实现完整生物传感器的构建。研究内容主要分为以下几个方面:(1)天然TNT感应元件发掘选择实验室遗传操作最为明晰的大肠杆菌入手,进行大肠杆菌的TNT天然感应元件挖掘。为了便于启动子文库的构建与筛选,我们首先构建了一个可用于启动子筛选的载体p TJH629,向载体中引入了大肠杆菌低拷贝复制子p SC101 ori。通过提取纯化E.coli K-12 MG1655基因组,并利用SAU3AI内切酶对其完全酶切,以lux CDABE化学发光为报告手段构建大肠杆菌基因组天然启动子文库,经过高低浓度TNT的两轮筛选,在文库中得到具有一定特异性和灵敏度的5个启动元件,并对5个启动元件进行特异性、灵敏度、时效性分析,发现其具有较好的启动活性。通过对5个元件基因序列的进一步分析,在大肠杆菌基因组中比对得到相应位置序列信息,通过数据库比对以及启动子在线预测等方法,得到了各个元件序列中可能存在的启动序列。接着利用体外直接退火扩增的方法,得到这些序列,并针对启动元件对TNT的敏感性进行研究,以对元件的最小功能序列进行确证,最后确证了其中两个元件发挥功能的最小序列top Ap4和rec EA4。(2)基于应激损伤机制的人工启动子文库构建与筛选通过上一步中对大肠杆菌基因组中启动元件的筛选发现,top A和rec EA4均属于细菌SOS家族成员,同时结合文献调研,发现细菌应急损伤家族可以受到TNT的诱导反应。因此我们进一步对SOS家族的基因启动子进行了考察,从中得到了几个对TNT有明显诱导反应的启动子。通过对筛选得到的SOS启动元件进行序列分析,从其中序列共性较多的启动子(sul A、rec A、umu DC)着手,对其序列的保守区进行提取,对其可变区进行完全随机突变,构建SOS启动子的随机突变文库。在文库中对TNT感应情况进行考察,从中筛选出了5个可受TNT调控的全新的SOS启动子,通过对启动特性的考察,发现其在保证特异性、时效性等特性的基础上其灵敏度较野生型SOS启动子都有显著提升。(3)恶臭假单胞菌Xyl R5-Pu-GFP测线路构建恶臭假单胞菌mt-2能够以甲苯硝基衍生化合物中的硝基作为氮源进行生理代谢,因此恶臭假单胞菌中肯定存在可受TNT诱导的调控元件,根据文献调研发现其发挥功能的关键元件为TOL质粒上的Xyl R-Pu线路。Xyl R蛋白作为恶臭假单胞菌甲苯代谢通路中的关键调控因子,可受甲苯及其衍生化合物的调控反应,激活上游的Pu启动子,根据此调控原理,我们以文献报道的对2,4-Dinitrotoluene(2,4-DNT)特异的Xyl R突变体Xyl R5为调控因子,以GFP为报告基因,构建了Xyl R-Pu-GFP基因调控线路。利用重组工程方法将线路整合到假单胞菌基因组上,并通过Cre-lox P实现了构建过程中抗性基因的敲除,实现了生物传感器基因工程菌的菌株构建。同时搭建了一个质粒平台p SN129,可通过对平台上的元件进行替换,实现线路功能的转换。(4)可受阿拉伯糖诱导的细菌自裂解模块构建为了实现基因工程菌对环境的无污染、无残留,本研究还开展了对生物传感器的检测后自毁模式的研究。通过文献调研发现了T4噬菌体的穿孔素蛋白Holin与T4溶菌酶的配合使用可调控实现细菌自杀,我们以此为基础设计构建了p BAD-Holin-Lysozyme-Anti Holin的自杀线路,通过引入Holin拮抗蛋白Anti Holin的表达,实现了含有自杀表达模块的菌株的正常生长,同时通过替换Anti Holin的启动子,实现其不同强度的表达,也可使自杀的起效时间、自杀强度高低得到一定控制。综上所述,在本研究中我们以大肠杆菌基因组为模板,构建了基因组天然启动子文库,从中筛选得到了5个可受TNT诱导的天然启动子元件,其启动活性均达到或超过了国际上报道的元件的领先水平;结合筛选结果与文献调研,我们通过对大肠杆菌SOS应激损伤系统的启动子筛查,得到了几个可受TNT调控的SOS启动子,通过对其进行序列分析,设计了一个SOS启动子的随机突变文库,并在文库中筛选得到了5个全新的SOS启动元件,并且其灵敏度较同类元件有显著提高;通过对假单胞菌天然元件Xyl R-Pu的应用,我们构建了Xyl R5-Pu-GFP基因工程菌,并实现了基因组引入抗性的剔除,并且构建了一个基因线路平台p SN129,可便捷的替换元件改变功能;通过对T4噬菌体Holin蛋白与穿孔素蛋白作用原理,设计了一条阿拉伯糖诱导的细菌自裂解线路。本研究工作为以TNT为靶标的地雷检测生物传感器的构建提供了更多的感应元件以及模块,为后续生物传感器的完整构建打下基础。