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红胞藻(Rhodomonas salina),隐藻门,红胞藻属,含有丰富的蛋白质、脂肪酸、多糖类等物质,具有多种生物活性,如免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗炎、抗衰老、降血压、降血脂等。藻红蛋白有多种分类,现有研究主要是针对B-藻红蛋白和R-藻红蛋白结构、性质及应用方面较多,而对红胞藻藻红蛋白研究较少。本论文以红胞藻藻红蛋白为研究对象,采用反复冻融法、硫酸铵盐析法以及Sephacryl S100HR凝胶层析法进行提取纯化;利用紫外-可见光吸收光谱、荧光光谱及凝胶电泳对藻红蛋白纯度进行分析鉴定;通过MALDI-TOF/TOF质谱分析其亚基组成及分子量大小;以凝胶电泳、紫外-可见光吸收光谱和荧光光谱测定不同环境因素下藻红蛋白的降解规律;最后以人结肠癌细胞HT29为细胞模型,探究红胞藻藻红蛋白降解产物(3-10KD)的抗肿瘤作用及其相关作用机制,为开发新的抗肿瘤药物提供理论依据,同时为进一步拓宽红胞藻的应用领域,提高其应用价值和经济价值奠定理论基础。主要研究成果如下:
(1)采用反复冻融法破壁红胞藻细胞,使其高效释放藻红蛋白;继而用不同浓度梯度的硫酸铵(10%、30%、50%、60%和80%)进行盐析;最后,采用Sephacryl S100HR凝胶层析法进行纯化得到藻红蛋白样品(纯度高达7.56),符合试剂级要求(OD545/OD280>4)。
(2)通过紫外-可见光吸收光谱、荧光光谱、Native-PAGE和SDS-PAGE鉴定红胞藻藻红蛋白的纯度。紫外-可见光吸收光谱结果表明,红胞藻藻红蛋白只有545nm一个特征吸收峰;荧光光谱分析结果表明,红胞藻藻红蛋白的激发波长为545nm,最适发射波长为580nm;Native-PAGE和SDS-PAGE结果表明,红胞藻藻红蛋白中含有两个亚基条带。
(3)MALDI-TOF/TOF质谱法中MS结果显示,红胞藻藻红蛋白的其中一个亚基为20KD左右;MS/MS多肽片段信息结果表明,该亚基属于β亚基。
(4)通过凝胶电泳、紫外-可见光吸收光谱和荧光光谱法测定不同环境下藻红蛋白的降解规律。结果显示,藻红蛋白最适宜的保存温度为4℃,当温度高于25℃时,降解时间越长,藻红蛋白降解程度越大;在pH3-10之内时,藻红蛋白能够稳定存在,当在极端酸性和碱性条件下时,藻红蛋白易变性,且其荧光和紫外特征吸收峰基本消失;随着脲素浓度的增加,藻红蛋白的荧光和紫外特征吸收峰逐渐下降,当浓度高于4M时,荧光和紫外特征吸收峰的变化趋势基本一致,表明在脲素浓度为4M时可使藻红蛋白完全变性;随着SDS浓度增加,藻红蛋白出现沉淀,荧光和紫外特征吸收峰基本消失。
(5)Western Blot实验结果表明,红胞藻藻红蛋白的降解产物(3-10KD)能够在60min内诱导HT29细胞中ERK和JNK蛋白的磷酸化,从而激活MAPK通路中ERK和JNK信号转导通路,进而调节下游相关凋亡蛋白(p53、Bim、Bad、Bak和Bax等)的表达;凋亡蛋白中单聚化的Bax进入线粒体内,从而导致Ca2+内流和细胞色素C外流,进而激活Caspase3凋亡蛋白,最终促使HT29细胞发生细胞凋亡。
综上所述,红胞藻藻红蛋白含有已知β亚基;其降解产物(3-10KD)对HT29细胞具有明显的凋亡作用,可以作为一种新型的抗肿瘤物质,具有较为广阔的开发前景。
(1)采用反复冻融法破壁红胞藻细胞,使其高效释放藻红蛋白;继而用不同浓度梯度的硫酸铵(10%、30%、50%、60%和80%)进行盐析;最后,采用Sephacryl S100HR凝胶层析法进行纯化得到藻红蛋白样品(纯度高达7.56),符合试剂级要求(OD545/OD280>4)。
(2)通过紫外-可见光吸收光谱、荧光光谱、Native-PAGE和SDS-PAGE鉴定红胞藻藻红蛋白的纯度。紫外-可见光吸收光谱结果表明,红胞藻藻红蛋白只有545nm一个特征吸收峰;荧光光谱分析结果表明,红胞藻藻红蛋白的激发波长为545nm,最适发射波长为580nm;Native-PAGE和SDS-PAGE结果表明,红胞藻藻红蛋白中含有两个亚基条带。
(3)MALDI-TOF/TOF质谱法中MS结果显示,红胞藻藻红蛋白的其中一个亚基为20KD左右;MS/MS多肽片段信息结果表明,该亚基属于β亚基。
(4)通过凝胶电泳、紫外-可见光吸收光谱和荧光光谱法测定不同环境下藻红蛋白的降解规律。结果显示,藻红蛋白最适宜的保存温度为4℃,当温度高于25℃时,降解时间越长,藻红蛋白降解程度越大;在pH3-10之内时,藻红蛋白能够稳定存在,当在极端酸性和碱性条件下时,藻红蛋白易变性,且其荧光和紫外特征吸收峰基本消失;随着脲素浓度的增加,藻红蛋白的荧光和紫外特征吸收峰逐渐下降,当浓度高于4M时,荧光和紫外特征吸收峰的变化趋势基本一致,表明在脲素浓度为4M时可使藻红蛋白完全变性;随着SDS浓度增加,藻红蛋白出现沉淀,荧光和紫外特征吸收峰基本消失。
(5)Western Blot实验结果表明,红胞藻藻红蛋白的降解产物(3-10KD)能够在60min内诱导HT29细胞中ERK和JNK蛋白的磷酸化,从而激活MAPK通路中ERK和JNK信号转导通路,进而调节下游相关凋亡蛋白(p53、Bim、Bad、Bak和Bax等)的表达;凋亡蛋白中单聚化的Bax进入线粒体内,从而导致Ca2+内流和细胞色素C外流,进而激活Caspase3凋亡蛋白,最终促使HT29细胞发生细胞凋亡。
综上所述,红胞藻藻红蛋白含有已知β亚基;其降解产物(3-10KD)对HT29细胞具有明显的凋亡作用,可以作为一种新型的抗肿瘤物质,具有较为广阔的开发前景。