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副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉泽氏病(也称猪副猪嗜血杆菌病)的病原体,可导致多发性浆膜炎、脑膜炎、败血症等症状,病死率高,每年可造成我国养猪业重大经济损失,是影响我国甚至全球养猪业的重要细菌性疫病之一。迄今为止,对其毒力相关因子和致病机理了解不多。ArcA是许多细菌的全局调控因子,主要调控细菌的厌氧氧化还原平衡,除此之外,还具有调节细菌的能量代谢、血清抗性和细菌毒力等许多功能。本研究旨在以本地分离的副猪嗜血杆菌强毒株EP3(血清13型)为亲本株,利用遗传操作技术构建了AarcA缺失株,对其进行生物学特性的研究,并利用比较转录组学和比较蛋白质组学方法,进一步阐明ArcA在副猪嗜血杆菌致病过程中的作用和分子机制。具体工作如下:1.构建副猪嗜血杆菌EP3菌株arcA基因缺失株用pET-28a质粒构建了pET28a-arcA表达载体,转入大肠杆菌E.coliBL21中进行诱导表达。对表达条件进行了优化,该载体以包涵体形式可大量表达ArcA蛋白。融合蛋白经纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体,获得相应ArcA蛋白的抗血清。选择pK18mobsacB“自杀质粒”构建基因缺失株。利用自然转化方法,构建了质粒pAD,转化HPSEP3菌株后,获得HPS△arcA缺失株。构建了HPSarcA基因单拷贝的互补质粒pCA,将质粒pCA转化到△arcA缺失株后,获得其互补菌株C-△arcA。通过PCR检测、western-blotting和基因测序进行鉴定,证实HPSEP3菌株arcA基因缺失株构建成功。2.副猪嗜血杆菌野毒株EP3株、△arcA和互补株C-△arcA生物学特性研究通过生长特性的测定,发现在厌氧条件下AarcA缺失株的生长速度明显变慢,互补株生长速度和野毒株一样;但是在有氧条件下,缺失株的生长速度没有明显变化,说明了在厌氧环境下ArcA调节了EP3菌株的生长,缺失后导致生长缓慢。在抵抗血清中补体杀菌作用方面,EP3株具有很高的抵抗血清杀菌的能力;但是ArcA的缺失显著地降低了菌株对猪血清的抵抗能力;互补株恢复抗血清的能力,说明了ArcA参与抵抗血清中补体杀菌作用。在细菌自凝集方面arcA基因缺失后没有明显变化。以BALB/c小鼠为模型进行动物毒力试验,结果显示△arcA缺失株的毒力显著减弱,而互补株的毒力恢复正常。生物被膜形成分析表明,ArcA的缺失显著地降低了HPS生物被膜的形成能力,而互补株可以恢复此能力,说明了ArcA参与了HPS生物被膜形成。3.副猪嗜血杆菌野毒株EP3株和△arcA缺失株比较转录组学的研究鉴于△arcA缺失株具有显著的生物学特性变化,本研究应用RNA-seq技术对野毒株EP3和△arcA缺失株进行比较转录组学的研究,进一步探索生物学表型产生的原因。鉴定出73个显著差异基因。在缺失株中,其中57个基因转录升高,而16个基因转录下降。按照GO注释和COG分类,差异基因主要影响糖代谢、转录翻译因子、脂类代谢、氨基酸代谢、核酸代谢等,表明这些差异基因主要涉及HPS的能量代谢和细胞膜的合成等过程。4.副猪嗜血杆菌野毒株EP3株和△arcA缺失株比较蛋白组学的研究应用iTRAQ技术对野毒株EP3和△arcA缺失株进行比较蛋白组的研究,探索生物学表型产生的原因,鉴定出119个显著差异蛋白。在AarcA缺失株中,其中54个蛋白表达上调,而65个蛋白是表达下调。按照GO注释和COG分类,差异蛋白主要影响三羧酸循环、磷酸肌醇代谢、二羧酸代谢、鞘脂类代谢、β-丙氨酸代谢、磷酸戊糖途径、丙酸代谢、谷胱甘肽代谢、NAD代谢、过氧化氢酶体、嘌呤代谢、次生代谢物的合成、氮代谢、糖酵解、果糖和甘露糖代谢、半乳糖的代谢、淀粉和蔗糖代谢、泛酸的生物合成和其它多糖降解途径等。以上结果揭示了副猪嗜血杆菌缺失arcA基因后菌株生长缓慢和毒力减弱的部分原因。因此,ArcA缺失导致了广泛的蛋白表达的改变,能为进一步解释△arcA缺失株生物学特性变化的原因和为研究ArcA功能和分子机制提供了有价值的信息。